Question

【題目】基因工程中，GUS基因編碼的酶可將無色底物生成藍色產物，GFP基因會產生綠色熒光蛋白，這兩種基因都可作為標記基因來研究發育生物學的問題。利用雙CRISPR/Cas9系統和Cre/loxP重組酶系統技術可更好地實現該研究。請據圖作答：

（1）圖1為雙CRISPR/Cas9系統作用示意圖。該系統能夠特異性識別DNA序列并切割特定位點，圖中行使這些功能的分子結構分別是____________、______________。圖中向導RNA與DNA結合的原理是______________。將刪除區切割后，轉入基因與原DNA片段可通過形成_______________拼接起來，形成新的DNA序列。

（2）雙CRISPR/Cas9系統可直接在靶細胞內起作用，與傳統的基因工程相比，該操作無需_______________（填寫工具）。與質粒載體導入外源基因比，雙CRISPR/Cas9系統編輯的基因可以不含________________.

（3）圖2為Cre/loxP重組酶系統作用示意圖。利用雙CRISPR/Cas9系統可精準地將loxP序列、GUS基因及GFP基因連接，接上35s啟動子之后可在組織中檢測出藍色區而無綠色熒光區，這是由于____________基因自身無啟動子而無法表達。Cre基因是重組酶基因，經38℃熱處理后可被激活表達，在此前提下組織中可檢測出綠色熒光區，據此分析綠色熒光區形成的原因是___________________________________________________________________________采用_________________________等手段可以擴大組織中綠色熒光區的面積。

Answer 1

【答案】向導RNA Cas9蛋白 堿基互補配對 磷酸二酯鍵 載體（運載體、質粒） 啟動子、終止子和標記基因 GFP 重組酶能（特異性識別并）切割loxP序列，使GFP基因得以表達 延長熱處理時間

【解析】

生物的性狀受基因控制，生物能發出綠色熒光是由于生物的DNA分子上含有綠色熒光蛋白基因，基因能通過控制蛋白質的結構直接控制生物性狀；圖1為雙CRISPR/Cas9系統作用示意圖，由圖可知，向導RNA中有一段識別序列，具有識別功能，可以與特定的DNA序列發生堿基互補配對，Cas9蛋白則可切割所識別的特定DNA序列；導入的基因和原DNA片段之間需要重新形成磷酸二酯鍵才能連接在一起，形成新的DNA分子，該過程類似于基因工程操作中的構建基因表達載體步驟，據此作答。

（1）圖1為雙CRISPR/Cas9系統作用示意圖。該系統能夠特異性識別DNA序列并切割特定位點的原因分別是向導RNA能識別特定序列、Cas9蛋白能定點切割DNA序列。圖中向導RNA與DNA結合的原理是堿基互補配對。將刪除區切割后，轉入基因與原DNA片段可通過形成磷酸二酯鍵拼接起來，形成新的DNA序列。
（2）雙CRISPR/Cas9系統可直接在靶細胞內起作用，與傳統的基因工程相比，該操作無需載體（運載體）。與質粒載體導入外源基因比，雙CRISPR/Cas9系統編輯的基因可以不含啟動子、終止子和標記基因。
（3）GUS基因編碼的酶可將無色底物生成藍色產物，GFP基因會產生綠色熒光蛋白，在組織中檢測出藍色區而無綠色熒光區，說明GUS基因正常表達而GFP基因不能正常表達，根據“Cre基因是重組酶基因，經38℃熱處理后可被激活表達，在此前提下組織中可檢測出綠色熒光區”提示，可見GFP基因的正常表達需以Cre基因被激活表達為前提，即GFP基因自身無啟動子，無法啟動自身的表達。通過用Cre重組酶處理后，切割loxP序列，產生GFP基因的啟動子，使GFP基因得以表達。由于Cre基因是重組酶基因，經38℃熱處理后可被激活表達，因此熱處理時間越長，越有利于基因的表達，綠色熒光區的面積就越大。