Question

4．在現代農業中，常在飼料中加入一定量的尿素來飼養牛等牲畜。因其有特殊的器官——瘤胃，在瘤胃中生活著多種微生物，其中許多微生物以尿素作為唯一氮源。某同學設計了如下實驗，對能分解尿素的細菌進行分離和計數。

Ⅰ.取樣：到屠宰場，在剛宰殺的牛的瘤胃中取樣，將樣品裝入事先準備好的信封中密封。

Ⅱ.制備培養基：制備牛肉膏蛋白胨培養基和選擇培養基。將菌液稀釋相同的倍數，在牛肉膏蛋白胨培養基上生長的菌落數應明顯多于選擇培養基上的數目。由于初次實驗，選擇了一個較寬的稀釋范圍。并且每個稀釋度下需要3個選擇培養基，1個牛肉膏蛋白胨培養基。

Ⅲ.微生物的培養與觀察：按稀釋度的順序分別吸取 0.1 mL進行平板涂布操作。將涂布好的培養皿放在30 ℃下培養，并且需要無氧條件。比較兩種培養基中菌落的數量、形態等，并做好記錄。挑選選擇培養基上不同形態的菌落接入含酚紅指示劑的培養基中，觀察是否產生顏色反應。

Ⅳ.細菌的計數：當菌落數目穩定時，選取平板計數。

請回答下列問題：

(1)制備牛肉膏蛋白胨培養基的目的是什么？

(2)為什么每個稀釋度下需要3個選擇培養基？

(3)上述培養時，為什么需要無氧條件？

(4)含酚紅的培養基應用的目的是什么？結果會呈現什么樣的顏色反應？原理是什么？

(5)計數時應選什么樣的平板進行計數？怎樣計算出樣品中的細菌數目？

Answer 1

答案：(1)作為對照，用來判斷選擇培養基是否起到了選擇作用。

(2)每個稀釋度下涂布3個平板，是作為重復組，以增強實驗結果的說服力與準確性。

(3)由于瘤胃中的微生物多為厭氧菌，接觸空氣會受抑制甚至死亡。

(4)鑒別，看是否有分解尿素的細菌存在。如有該細菌存在結果會變紅。原理是分解尿素的細菌產生脲酶，催化尿素分解產生NH₃，使培養基 pH升高，酚紅指示劑呈紅色。

(5)選擇菌落數在30～300的平板進行計數。根據平板所對應的稀釋度，對3個平板進行重復計數。然后求出平均值，以此估算樣品中細菌的數目。

解析：本題是從反芻動物瘤胃中分離分解尿素的細菌的過程，是對利用選擇培養基分離目的菌株基礎知識的鞏固，解題時注意以下問題：

(1)要設立基礎培養基——牛肉膏蛋白胨培養基作為對照，觀察選擇培養基是否具選擇作用。

(2)要設立重復組，取平均值，如每一稀釋度下涂布至少3個平板，以增強實驗結果的說服力與準確性。

(3)瘤胃是一個缺氧環境，生活的微生物多為厭氧菌，分離時要注意創造無氧環境。

(4)進一步鑒別分解尿素的細菌需在培養基中加酚紅指示劑，若此種菌存在，則會變紅，原理是分解尿素的細菌能產生脲酶，催化反應：CO(NH₂)₂＋H₂OCO₂＋NH₃。因產生NH₃，使培養基堿性增強，pH升高，因此酚紅指示劑呈現紅色反應。

(5)為保證結果準確，計數應選擇菌落數在30～300的平板。