Question

【題目】圖1是科研工作者利用差異雜交法獲取相關目的基因的研究；圖2是克隆出的花色基因C，和實驗所用質粒表達載體簡圖（箭頭所指分別為限制性核酸內切酶EcoRI、BamlI的酶切位點，ampR為青霉素抗性基因，tetR為四環素抗性基因，P為啟動子，T為終止子，ori為復制原點），擬將其與質粒重組，再借助農桿菌導入菊花中。請據圖回答問題：

(1)圖1中，A過程需要用____________酶，D過程需要篩選____________（填“未雜交”或“雜交分子”）的含32P的cDNA單鏈，繼而通過人工合成，獲得雙鏈cDNA，并用其構建基因文庫。

(2)圖2中菊花組織培養的培養基常用_________方法滅菌。菊花的組織培養過程③需添加生長素和細胞分裂素，當其比值_________（升高/降低/適中）促進生根。

(3)圖3表示運用影印培養法（使一系列培養皿的相同位置上能出現相同菌落的一種接種培養方法）檢測基因表達載體是否導入了農桿菌。培養基除了含有細菌生長繁殖必需的成分外，培養基A和培養基B分別還含有__________、__________。從檢測篩選的結果分析，含有目的基因的是___________（填數字）菌落中的細菌。

(4)為確定基因C是否整合到菊花染色體的DNA上，可用放射性同位素標記的___________作為探針進行分子檢測，還需要在個體水平上通過_________鑒定。

(5)本實驗中，對質粒進行酶切時，只能單一酶切，不能雙酶切，原因是____________。為鑒定篩選出的菌落中是否含有正確插入目的基因的重組質粒，擬設計引物進行PCR鑒定。下圖所示為6條引物在正確重組質粒中的相應位置，PCR鑒定時應選擇的一對引物是______________可以擴增出了450bp片段。若目的基因反向連接了，那么選圖中引物__________，可從某一菌落的質粒中擴增出了500bp片段。

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Answer 1

【答案】逆轉錄 未雜交 高壓蒸汽滅菌 升高 青霉素（ampR） 四環素（tetR）（或ampR和tetR） 4和6 基因C 觀察花色 基因c只有EcoRI的酶切位點，當質粒被同一種酶切割后產生同樣的末端基因C才能和質粒連接成環狀（只答基因C只有EcoRI的酶切位點即可） db bc

【解析】

基因工程技術的基本步驟：（1）目的基因的獲取：方法有從基因文庫中獲取、利用PCR技術擴增和人工合成。（2）基因表達載體的構建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等。

（3）將目的基因導入受體細胞：受體細胞不同，導入的方法也不一樣。將目的基因導入植物細胞的方法有農桿菌轉化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因導入動物細胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因導入微生物細胞的方法是感受態細胞法。

（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉基因生物染色體的DNA是否插入目的基因：DNA-DNA分子雜交技術；②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA：DNA-RNA分子雜交技術；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質：抗原-抗體雜交技術。個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

分析圖2：圖示為轉基因抗鹽煙草的培育過程，首先構建基因表達載體；其次采用農桿菌轉化法將目的基因導入受體細胞（煙草細胞）；再采用植物組織培養技術將含有目的基因的煙草細胞培養成轉基因抗鹽煙草。

分析圖3：圖2是篩選含有重組質粒的農桿菌的過程，培養基A和B中應該分別加入氨芐青霉素、四環素。

（1）據圖可知圖1為構建基因文庫的過程，其中需要單鏈mRNA通過A過程形成雜交雙鏈分子，需要逆轉錄酶，D過程需要回收未雜交的含32P的cDNA單鏈，繼而通過人工合成，獲得雙鏈cDNA，并用其構建基因文庫。

（2）培養基通過采用高壓蒸汽滅菌法處理。菊花的組織培養過程③需添加生長素和細胞分裂素，當生長素比值增大時有利于生根。

（3）用EcoRI、BamlI兩種限制酶對質粒進行切割時，會破會四環素抗性基因，但不會破壞氨芐青霉素抗性基因，因此導入重組質粒的農桿菌能在含有氨芐青霉素的培養基上能生存，但不能在含有四環素培養基上生存，所以培養基A和培養基B分別還含有氨芐青霉素、四環素，含目的基因的是4和6菌落中的細菌。

（4）為確定基因C是否整合到菊花染色體的DNA上，可用放射性同位素標記的基因C為探針進行分子檢測，由于基因C控制花色的形成，因此還需要在個體水平上通過觀察花色進行鑒定。

（5）據圖分析，根據目的基因插入的位置和PCR技術的原理分析，PCR技術要求兩種引物分別和目的基因的兩條單鏈結合，沿著相反的方向合成子鏈，因此要擴增出450bp片段，PCR鑒定時應該選擇的一對引物是db；根據題意和圖形分析，若目的基因發生了反向連接，用圖中的另外一對引物bc從某一菌落的質粒中可以擴增出500bp的片段。