Question

【題目】如圖是將某抗原基因導入大腸桿菌內制備“工程菌”的示意圖，圖中BamHI、EcoRI、SmaI、HindⅢ分別代表相應的限制酶。回答下列問題：

（1）獲得抗原基因的途徑可以是以抗原蛋白的mRNA為模板，在______酶的催化下，獲得所需基因。

（2）利用質粒作為運載體時，常常需要對天然質粒進行改造，若圖中P為啟動子，它是_____的位點；青霉素抗性基因和四環素抗性基因可作為____基因，其作用是_____。

（3）利用PCR技術擴增抗原基因時，需要在反應體系中添加的物質有_____、成對的_______、4種dNTP和熱穩定性DNA聚合酶等，擴增過程可以在PCR擴增儀中完成。

（4）構建重組質粒時，一般使用BamH I和HindⅢ對含抗原基因的DNA片段和質粒分別進行切割，而不單獨使用EcoR I切割，是由于BamH I和HindⅢ共同切割可以防止_____。篩選該工程菌時應進行兩次篩選，先在添加____的培養基中選出導入質粒的大腸桿菌單菌落，將單菌落分別接種到液體培養基中，培養一段時間后，取菌液在添加_____的平板上劃線，將導入重組質粒的工程菌篩選出來。

Answer 1

【答案】反轉錄 RNA聚合酶識別和結合 標記 便于鑒別和篩選出含有目的基因的受體細胞 抗原基因 引物 質粒和目的基因自身環化，同時也可防止目的基因與質粒反向連接 青霉素 四環素

【解析】

分析質粒：質粒上含有BamHI、EcoRI、HindⅢ的切割位點，其中HindⅢ限制酶的切割位點位于四環素抗性基因上。

分析圖抗原基因：質粒上有限制酶EcoRI、BamHⅠ、SmaI 、HindIII四種限制酶的識別序列和切割位點，其中SmaI的切割位點位于抗原基因上。

（1）獲得抗原基因有兩條途徑：一是以抗原基因的mRNA為模板，在逆轉錄酶的催化下，反轉錄合成雙鏈DNA，從而獲得所需基因；二是根據目標蛋白質的氨基酸序列，推測出相應的mRNA序列，然后按照堿基互補配對原則，推測其DNA的脫氧核苷酸序列，再通過人工合成（化學）方法合成所需基因。

（2）啟動子是RNA聚合酶識別和結合的部位。可以驅動目的基因的轉錄形成mRNA。青霉素抗性基因和四環素抗性基因是做標記基因。標記基因的作用是鑒別受體細胞中是否含有目的基因（以便篩選出含有目的基因的細胞）。

（3）PCR是一種在生物體外復制特定DNA片斷的核酸合成技術，它是利用DNA雙連復制的原理。利用PCR技術擴增DNA時，需要在反應體系中添加的有機物質有：模板DNA（抗原基因）、熱穩定性DNA聚合酶、引物和4種脫氧核糖核苷三磷酸。因為DNA復制時，子鏈總是從5′向 3′方向延伸，而子鏈與模板鏈反向平行。

（4）構建含抗原基因的重組質粒時，用SmaⅠ切割會破抗原基因，不能使用SmaⅠ切割。由于抗原基因和質粒性基因上都含有限制酶BamHI、EcoRI、HindⅢ的切割位點，如果單獨用限制酶EcoRI 切割，會形成相同的黏性末端，導致質粒和抗原基因自身的環化。用BamHI和HindⅢ同時處理，這樣使目的基因兩端的黏性末端不同，既可防止質粒和含抗原基因的外源DNA片段自身環化，也可以防止抗原基因和質粒反向連接，同理，也可以防止質粒自身環化。分析圖形可知，HindⅢ酶切割會導致四環素抗性基因破壞，因此為了篩選出含轉入抗原基因的重組質粒的大腸桿菌，應在篩選平板培養基中添加青霉素，平板上長出的菌落，需要進一步鑒定才能篩選出含有目的基因的大腸桿菌的單菌落，這是由于平板上長出的菌落有的含有質粒，有的含有重組質粒。需再一次篩選，需取菌液在添加四環素的平板上劃線，將導入重組質粒的工程菌篩選出來。