Question

【題目】研究發現，斑馬魚的HuC基因在早期胚胎神經細胞中選擇性表達，為了研究該基因轉錄起始位點上游的部分序列對該基因表達的影響，科研人員做了如下實驗。

（1）為確定HuC基因的轉錄起始位點，提取斑馬魚早期胚胎神經細胞的總RNA，以與__________互補的一段單鏈DNA序列做為引物，加入________酶，獲得cDNA。對該cDNA的序列進行測定，與HuC基因的序列進行比對，確定轉錄起始位點，定為+1號堿基，其上游的堿基定為負值。

（2）為了探究轉錄起始位點上游不同長度片段在基因轉錄中的作用，科研人員從__________（選填“基因組”或“cDNA”）文庫中獲取該轉錄起始位點上游的片段，用__________酶處理此片段和含GFP （綠色熒光蛋白）基因的載體，獲得重組DNA分子。

（3）用不同種類的限制酶重復步驟（2），獲得不同長度的重組DNA分子，通過顯微注射方法分別導入斑馬魚的__________細胞，通過熒光顯微鏡觀察早期胚胎神經細胞、肌肉細胞中的熒光強度，結果如圖所示。

注：“+”多少表示熒光強度，“-”表示未檢測到熒光。虛線表示直接連接在一起。

①獲得圖中所示的重組DNA分子，需要用到的限制酶有__________種。

②據圖分析，缺失HuC基因上游的__________片段就會造成HuC基因在所有細胞中表達被完全抑制。-1962bp至-432bp片段的存在會__________HuC基因在肌肉細胞中的表達，對神經細胞中的表達__________。

Answer 1

【答案】 HuC mRNA 逆轉錄 基因組 限制酶和DNA連接 受精卵 7 -251bp至-1bp 部分抑制 無顯著影響

【解析】試題分析：分析題圖可知，將綠色熒光蛋白基因與轉錄起點上游-2771的堿基序列重組形成重組質粒，神經細胞綠色熒光蛋白基因表達最強烈，肌肉細胞的綠色熒光蛋白基因不表達，-2473、-1962、-1162、-431、--251分別與綠色熒光蛋白基因重組形成重組DNA分子，神經細胞的綠色熒光蛋白基因表達部分受抑制，而肌肉細胞中的綠色熒光蛋白基因表達逐漸增強，缺少251bp至-1bp片段，綠色熒光蛋白基因在神經細胞和肌肉細胞都不表達。

（1）由題意知，研究HuC基因的轉錄起始位點的方法是通過逆轉錄形成cDNA，然后與HuC基因的序列比對進行確定，因此選擇逆轉錄的模板應該是HuC基因轉錄形成的mRNA，引物為與HuCmRNA互補的一段單鏈DNA序列，逆轉錄過程需要加入逆轉錄酶進行催化。
（2）探究轉錄起始位點上游不同長度片段在基因轉錄中的作用，應從基因組文庫中進行選擇該轉錄起始位點上游的不同長度的片段；基因重組技術所用到的酶是限制性核酸內切酶和DNA連接酶。
（3）重組DNA分子導入動物細胞常用的方法是顯微注射法，常用的受體細胞是受精卵。
①DNA重組過程中需要用限制性內切酶切割DNA分子和目的基因，由題圖可知，獲取-1162bp～-1bp與獲取-2771bp～-1163bp的酶相同、獲取-431～-1bp與-2771bp～-432bp酶相同，-251bp～-2771bp～-252bp酶相同，因此得圖中所示的重組DNA分子，需要用到的限制酶有7種。
②由題圖可知，缺失HuC基因上游的-251bp至-1bp片段，神經細胞和肌肉細胞都沒有綠色熒光，因此說明缺失HuC基因上游的-251bp至-1bp片段就會造成HuC基因在所有細胞中表達被完全抑制。-1962bp至-432bp片段的存在會部分抑制HuC基因在肌肉細胞中的表達，對神經細胞中的表達無顯著影響。