Question

【題目】回答下列（一）、（二）小題：

（一）開發山楂果醋恰好讓山楂中的有機酸豐富了果醋的酸味，同時也彌補生食山楂酸味大的缺陷，具體釀制山楂果醋分為以下三個階段，請將具體過程補充完整。

（1）制備山楂果原汁：選成熟的山楂果，在清水沖洗山楂果_______（填“之前”或“之后”）去梗。將山楂果切片并去籽，再添加_______，酶解適宜時間后壓榨取果汁。

（2）乙醇發酵：由于山楂果原汁_______，故發酵液中添加適量蔗糖，以獲得酒精含量較高的果酒。果汁中加入活化的________后，在適宜環境下發酵一段時間，當發酵液中停止_______，發酵完畢待過濾，或發酵至_______，上清液即為果酒，用虹吸法取出。

（3）醋酸發酵：將醋化醋桿菌進行擴大培養后，經檢查菌體生長正常并無雜菌污染后接種于山楂酒-水中進行發酵，整個發酵過程需要通入_______。在發酵后期加入0．3~0．4%的食鹽，其目的是調味和_______，以防止果醋被發酵分解。

（二）下圖為轉基因抗蟲煙草的培育流程，①②③④表示過程，其中②表示利用農桿菌轉入受體細胞�；卮鹣铝邢嚓P問題：

（1）在①過程構建重組質粒時，若用同一種限制性核酸內切酶處理Ti質粒和含目的基因的DNA片段，使兩者形成粘性末端用于拼接，這種方法的明顯缺點是目的基因和質粒________（答出2點即可）。另外，影響拼接效率的主要因素，除以上缺點和鹽離子濃度、滲透壓、溫度等環境因素外，還有_______（答出2點即可）。

（2）在②過程中，將圖示重組Ti質粒導入農桿菌時可用______處理農桿菌，以提高轉化效率。操作之后，需要特定的培養基對農桿菌進行篩選，其原因是_______，最終篩選到的對象在相應選擇培養基上的存活情況是________。

（3）在③過程常通過調節_______的適當配比，從愈傷組織誘導出芽和根的_____，并由此再生出新植株。獲得轉基因煙草后，再通過[④]_______過程實現多個世代組織培養。

Answer 1

【答案】之后 果膠酶（和果膠甲酯酶） 含糖量較低 干酵母（懸液） 出現氣泡 酵母下沉 無菌空氣/氧氣 抑制雜菌 反向拼接/倒接、（自身）環化 且的基因的濃度、質粒的濃度、反應時間 氯化鈣CaCl2 不是所有的農桿菌都接納了重組質粒 在含四環素培養基上存活，在含青霉素培養基上死亡 營養物質和生長調節劑/植物激素 項端分生組織 繼代培養

【解析】

1.釀酒和制醋是最古老的生物技術。與酒和醋的生產有關的微生物分別是酵母菌和醋桿菌，它們各有不同的菌種。菌種的不同，所產生的酒和醋的風味也不同。本實驗的內容是制作果酒和果醋，所用的原料是葡萄或其他果汁。葡萄酒是酵母利用葡萄糖進行酒精發酵(乙醇發酵)的產物。酵母菌只有在無氧條件下才能進行酒精發酵，即將葡萄糖氧化成乙醇，而且當培養液中乙醇的濃度超過16%時，酵母菌就會死亡。葡萄糖氧化成乙醇的反應式如下。

醋桿菌在有氧條件下才能將乙醇氧化為醋酸，醋桿菌所產生的醋酸可使培養液中醋酸的含量高達13%。

2. 基因工程技術的基本步驟：

（1）目的基因的獲�。悍椒ㄓ袕幕�因文庫中獲取、利用PCR技術擴增和人工合成．

（2）基因表達載體的構建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等．

（3）將目的基因導入受體細胞：根據受體細胞不同，導入的方法也不一樣．將目的基因導入植物細胞的方法有農桿菌轉化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因導入動物細胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因導入微生物細胞的方法是感受態細胞法．

（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術；②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA--分子雜交技術；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質--抗原-抗體雜交技術．個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等．

（一）（1）制備山楂果原汁通常選成熟的山楂果，為了避免雜菌污染，通常在用清水沖洗山楂果之后去梗。將山楂果切片并去籽，為了提高出汁率和澄清度，通常需要添加果膠酶（和果膠甲酯酶）處理，酶解適宜時間后壓榨取果汁。

（2）乙醇發酵時通常需要在發酵液中添加適量蔗糖，以彌補山楂果原汁含糖量較低的不足，同時也是為了滿足酵母菌發酵需要的底物量，從而獲得酒精含量較高的果酒。然后在果汁中加入活化的干酵母（懸液）后，置于適宜環境下進行發酵，由于酵母菌無氧呼吸的產物是酒精和二氧化碳，所以在發酵過程中會有氣泡產生，當發酵液中不再出現氣泡時，意味著發酵完成，然后過濾獲得果酒；也可發酵至酵母下沉后，用虹吸法取出上清液即為果酒。

（3）醋酸發酵中，由于醋化醋桿菌在有氧氣的條件下將酒精變為為乙醛，進而變為乙醇，所以整個發酵過程需要通入無菌空氣/氧氣。在發酵后期加入0．3~0．4%的食鹽，食鹽起到了調味和抑制雜菌的作用，進而防止果醋被其他微生物發酵分解。

（二）（1）①為構建基因表達載體的過程，若用同一種限制性核酸內切酶處理Ti質粒和含目的基因的DNA片段，則兩者會出現相同的粘性末端從而使得拼接變得容易，但這種方法存在明顯的缺點是在拼接時會出現反向拼接/倒接、（自身）環化等情況。影響拼接效率的因素主要有鹽離子濃度、滲透壓、溫度等環境因素，除此外，還有且的基因的濃度、質粒的濃度和反應時間也會影響拼接的效率。

（2）②過程為將目的基因導入受體細胞的過程，將圖示重組Ti質粒導入農桿菌時，為了提高導入的成功率，可用氯化鈣CaCl2 處理農桿菌，以提高轉化效率。因為導入的成功率較低，也就是說，并不是所有的農桿菌都接納了重組質粒，可能有的導入的是普通質粒，或者沒有導入成功，所以需要在特定的培養基對農桿菌進行篩選，由于圖中重組質粒上含有標記基因四環素抗性基因，而抗青霉素的基因被破壞，為了篩選出成功導入重組質粒的農桿菌，需要將待篩選的農桿菌分別接種在含有四環素的培養基和含青霉素的培養基上進行篩選，最終篩選到成功導入重組質粒的農桿菌在相應選擇培養基上的存活情況是在含四環素培養基上存活，在含青霉素培養基上死亡。

（3）③過程為再分化成植株的過程，該過程中需要通過調節營養物質和生長調節劑/植物激素的適當配比，從而實現由愈傷組織誘導出芽和根的項端分生組織的目的，并由此再生出新植株。獲得轉基因煙草后，再通過[④] 繼代培養過程實現多個世代組織培養，從而實現了轉基因煙草的擴大培養。