Question

【題目】水稻是世界上最重要的糧食作物之一，是全球約半數人口的主糧。然而水稻只有在磷營養充足的條件下才能保證高產。S基因是番茄線粒體中的磷轉運蛋白基因，科研人員將S基因轉入水稻體內，以期望獲得低磷條件下的高產水稻。操作流程如下：

（1）磷是構成____等物質的重要組成元素。土壤溶液中的磷濃度一般不超過2×10-12 mol/L，而植物細胞內的磷濃度卻大于10×10-4 mol/L，因此植物從土壤中吸收磷的方式是____。

（2）提取番茄細胞的總RNA經過____得到的cDNA，用限制酶處理后與載體結合并轉入受體菌體內，建立番茄的_____，從中獲取S基因。但此途徑得到的S基因兩端沒有限制酶識別序列，利用____技術添加相應序列并擴增。已知Ti質粒轉錄方向為順時針，相關酶切位點如下表。

通過測序已知S基因部分序列如下：

請補充擴增結束后，大多數DNA片段的堿基對序列____________ 。

（3）構建含S基因的表達載體時，通常用兩種限制酶切割含S基因的DNA片段和Ti質粒，限制酶作用部位為____（填化學鍵名稱）。將重組Ti質粒轉入農桿菌時，可以用____處理農桿菌，使得表達載體易于導入。為了使S基因能夠正確表達，還應插入的元件是什么_________（請在下圖中畫出并標注元件名稱）。

（4）將表達載體導入農桿菌以及農桿菌與水稻愈傷組織共培養時需要進行篩選，這兩步驟的培養基中都需要加入____，以篩選出成功導入表達載體的農桿菌和水稻愈傷組織。

（5）GUS基因的產物能催化無色物質K呈現藍色。經無色物質K處理愈傷組織并篩選出了呈現藍色的組織，說明____。

（6）農桿菌Ti質粒上的____序列，可以從農桿菌中轉移并隨機插入到被侵染植物細胞的____中。隨機挑選三個轉基因株系甲、乙、丙進行陽性檢測試驗。分別提取每個樣品的基因組，利用限制酶進行酶切電泳驗證，結果如下圖所示，

甲、乙、丙轉基因植株中分別被轉入了____個S基因。

（7）通過盆栽轉基因株系，分別在低磷條件下和磷正常條件下測定____以驗證轉入S基因是否能達到目的。測定結果如下圖。

結果顯示____，從而說明低磷條件下，S基因可以調控轉基因水稻對磷的吸收與積累，提高轉基因水稻產量。

（8）本實驗的研究價值在于____。

Answer 1

【答案】ATP、磷脂、核酸 主動運輸 逆轉錄 cDNA文庫（部分基因文庫） PCR 磷酸二酯鍵 Ca2+ 氨芐青霉素 S基因在水稻細胞中已成功表達 T-DNA 染色體DNA 3、2、3 單株產量 磷正常條件下單株產量與對照組相比，沒有顯著性差異；低磷條件下，三個轉基因株系的單株產量均顯著高于對照組 充分挖掘植物自身高效吸收與利用磷素的磷轉運蛋白，從根本上緩解低磷脅迫對包括水稻在內的作物影響，從而實現低投入、高產出、少污染的農業可持續發展具有重要的意義

【解析】

基因工程的基本操作程序：

1、目的基因的獲取：
（1）目的基因是指： 編碼蛋白質的結構基因。
（2）獲取方法：①從基因文庫中獲取；②人工合成（反轉錄法和化學合成法）；③PCR技術擴增目的基因。

2、基因表達載體的構建:
（1）目的：使目的基因在受體細胞中穩定存在，并且可以遺傳至下一代，使目的基因能夠表達和發揮作用。
（2）組成：目的基因+啟動子+終止子+標記基因。
①啟動子：是一段有特殊結構的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶識別和結合的部位，能驅動基因轉錄出mRNA，最終獲得所需的蛋白質。
②終止子：也是一段有特殊結構的DNA片段，位于基因的尾端。
③標記基因的作用：是為了鑒定受體細胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細胞篩選出來。常用的標記基因是抗生素基因。
（3）基因表達載體的構建過程：


3、將目的基因導入受體細胞:
（1）轉化的概念：是目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持穩定和表達的過程。
（2）常用的轉化方法：常用方法有農桿菌轉化法、顯微注射技術、Ca2+處理法。
（3）重組細胞導入受體細胞后，篩選含有基因表達載體受體細胞的依據是標記基因是否表達。

4、目的基因的檢測和表達：
（1）首先要檢測轉基因生物的染色體DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA分子雜交技術。
（2）其次還要檢測目的基因是否轉錄出mRNA，方法是用標記的目的基因作探針與mRNA雜交。
（3）最后檢測目的基因是否翻譯成蛋白質，方法是從轉基因生物中提取蛋白質，用相應的抗體進行抗原--抗體雜交。
（4）有時還需進行個體生物學水平的鑒定。如轉基因抗蟲植物是否出現抗蟲性狀。

（1）細胞中含磷的物質有核酸、ATP、磷脂；故磷是構成核酸、ATP、磷脂等物質的重要組成元素。細胞通過逆濃度梯度吸收磷，因此植物從土壤中吸收磷的方式是主動運輸。

（2）RNA經過逆轉錄得到的cDNA，用限制酶處理后與載體結合并轉入受體菌體內，建立番茄的cDNA文庫（部分基因文庫），從cDNA文庫中獲取目的基因S。S基因兩端沒有限制酶識別序列，通過PCR技術添加相應序列并擴增。已知Ti質粒轉錄方向為順時針，通過圖示中重組質粒分析，插入目的基因的左側所用的限制性酶是BamHI，右側所用的限制性酶是HindIII，再通過表格中限制性酶切割的具體堿基序列，結合S基因的堿基序列，可知擴增結束后，大多數DNA片段的堿基對序列：

。

（3）限制酶催化斷裂的是磷酸二酯鍵。將重組Ti質粒轉入農桿菌時，可以用Ca2+處理農桿菌，使農桿菌處于感受態。一個基因表達載體的組成，除了目的基因外，還必須有啟動子和終止子，啟動子位于基因的首端，終止子位于基因的尾端：。

（4）重組質粒中有標記基因--氨芐青霉素抗性基因，故為了篩選出成功導入表達載體的農桿菌和水稻愈傷組織，培養基中都需要加入氨芐青霉素。

（5）圖示中可以看出，重組質粒含GUS(β-葡糖苷酸酶)基因，GUS(β-葡糖苷酸酶)基因的產物能催化無色物質K呈現藍色，根據這一特性。經無色物質K處理愈傷組織并篩選出了呈現藍色的組織，說明S基因在水稻細胞中已成功表達。

（6）農桿菌Ti質粒上的T-DNA序列，可以從農桿菌中轉移并隨機插入到被侵染植物細胞的染色體DNA中。轉基因株系甲、乙、丙進行陽性檢測試驗結果，通過實驗結果看出，甲道出現3個條帶，乙道出現2個條帶，丙道出現3個條帶，故甲、乙、丙轉基因植株中分別被轉入了3、2、3個S基因。

（7）通過柱形圖的縱軸可知，通過盆栽轉基因株系，分別在低磷條件下和磷正常條件下測定單株產量相對值以驗證轉入S基因是否能達到目的。測定結果顯示磷正常條件下單株產量與對照組相比，沒有顯著性差異；低磷條件下，三個轉基因株系的單株產量均顯著高于對照組，從而說明低磷條件下，S基因可以調控轉基因水稻對磷的吸收與積累，提高轉基因水稻產量。

（8）本實驗的研究價值在于充分挖掘植物自身高效吸收與利用磷素的磷轉運蛋白，從根本上緩解低磷脅迫對包括水稻在內的作物影響，從而實現低投入、高產出、少污染的農業可持續發展具有重要的意義。