Question

【題目】請(qǐng)閱讀下文，分析回答下列問(wèn)題

正常細(xì)胞中含有抑癌的P53基因，能表達(dá)抗病毒蛋白，幫助修復(fù)輕度變異的基因，也能使重復(fù)變異的細(xì)胞發(fā)生凋亡而避免腫瘤的發(fā)生；若它失活而不能表達(dá)，則基因突變的細(xì)胞易形成腫瘤。基因治療腫瘤是根本的方法，腺病毒以其嗜好增殖細(xì)胞和對(duì)人體基本無(wú)害而成為良好的基因載體。野生型腺病毒含有抑制P53基因活性的55Kda基因，以及病毒復(fù)制基因E1，因此需要重新構(gòu)建有療效的、安全的腺病毒。圖甲、乙中箭頭所指為相應(yīng)限制酶切點(diǎn)。

（1）DNA解旋酶直接作用于脫氧核苷酸之間的____________鍵（化學(xué)鍵）；DNA限制酶直接作用于脫氧核苷酸之間的____________鍵（化學(xué)鍵）。

（2）構(gòu)建重組腺病毒時(shí)，限制酶最好選擇______________，理由是：既可以去除_____基因以防止病毒復(fù)制后損傷健康細(xì)胞，同時(shí)還能破壞___________基因以防止其____________。

（3）將目的基因與腺病毒重組時(shí)，重組的成功率較低，依然還有大量非重組的野生型病毒的DNA，這是因?yàn)?/span>_____________________________________。

（4）要獲得更多重組病毒，采用的方法是：獲取人體某腫瘤細(xì)胞→將E1基因?qū)�入腫瘤細(xì)胞的基因組中→重組病毒侵染含E1基因的腫瘤細(xì)胞→體外培養(yǎng)侵染的細(xì)胞。該過(guò)程中利用腫瘤細(xì)胞能不斷復(fù)制的特點(diǎn)可以為病毒提供更多的生活場(chǎng)所，那么選用含E1基因的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行重組病毒侵染的理由是____________________。篩選重組病毒，可采用離心分層純化法，其依據(jù)是________________________________________。

（5）某DNA分子片段含有1000個(gè)堿基對(duì)。經(jīng)擴(kuò)增后，分別只用限制酶EcoRⅠ與同時(shí)用EcoRⅠ和HalⅢ兩種方法切割，其電泳結(jié)果如圖丙所示，可推斷限制酶HalⅢ在該DNA片段上的切點(diǎn)有________________個(gè)。

（6）如果需將目的基因利用PCR技術(shù)擴(kuò)增10次，則需要在緩沖液中至少加入[_____]個(gè)引物。

A．210 B． 210 +2 C．211 D．211-2

Answer 1

【答案】氫 磷酸二酯鍵 BamHI和ECORI E1 55kda 抑制P53基因的活性 DNA對(duì)所連接的DNA片段沒(méi)有選擇性，導(dǎo)致切下片段可能和原DNA連接 可以讓病毒僅在含E1基因的腫瘤細(xì)胞中復(fù)制；而在不含E1基因的人體正常細(xì)胞中不能復(fù)制，提高安全性 重組病毒和非重組病毒分子量不同 2 D

【解析】

分析題圖：圖甲為野生型腺病毒DNA，其中含有抑制P53基因活性的55Kda基因，以及病毒復(fù)制基因E1，因此構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)應(yīng)破壞或去除55Kda基因和基因E1；圖乙為人體DNA片段，其中P53基因?yàn)槟康幕��?/span>.要獲得目的基因（P53基因），同時(shí)還要破壞或去除55Kda基因和基因E1，應(yīng)選用EcoRI和BamHI切割載體和含有目的基因的DNA。

（1）DNA解旋酶直接作用于脫氧核苷酸之間的氫鍵；DNA限制酶直接作用于脫氧核苷酸之間的磷酸二酯鍵。

（2）根據(jù)題干信息“野生型腺病毒含有抑制P53基因活性的55Kda基因，以及病毒復(fù)制基因E1”可知，構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，應(yīng)選用EcoRI和BamHI切割載體和含有目的基因的DNA，這樣既可以去除E1基因以防止病毒復(fù)制后損傷健康細(xì)胞，同時(shí)還能破壞55Kda基因以防止其抑制P53基因的活性。

（3）由于DNA對(duì)所連接的DNA片段沒(méi)有選擇性，導(dǎo)致切下片段可能和原DNA連接，因此將目的基因與腺病毒重組時(shí)，重組的成功率較低，依然還有大量非重組的野生型病毒的DNA。

（4）選用含E1基因的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行重組病毒侵染，可以讓病毒僅在含有E1基因的腫瘤細(xì)胞中復(fù)制，而在不含E1的人體正常細(xì)胞中不能復(fù)制，提高安全性.重組病毒與非重組病毒的DNA分子長(zhǎng)度不同，質(zhì)量（密度）也不同，因此篩選重組病毒時(shí)，可采用離心分層純化法。

（5）只用限制酶EcoRI切割能產(chǎn)生700kb、200kb和100kb三種長(zhǎng)度的DNA片段，同時(shí)用EcoRI和HalⅢ 兩種酶切割可產(chǎn)生420kb、280kb和100kb三種長(zhǎng)度的DNA片段，可見(jiàn)，限制酶HalⅢ又將長(zhǎng)度為700Kb的DNA片段切成420kb和280kb兩段，將長(zhǎng)度為200kb的DNA片段切成10Okb的兩段，由此可推斷限制酶HalⅢ在該DNA片段上的切割位點(diǎn)有2個(gè)。

（6）利用PCR技術(shù)將目的基因擴(kuò)增N次，至少需要的引物2N+1-2個(gè)。