Question

【題目】釀酒酵母不能利用木糖制約了利用植物原料生產乙醇的經濟效益。木酮糖激酶是木糖轉化、利用的關鍵酶，為提高酵母細胞中木酮糖激酶的表達量，科研人員將兩種啟動子與木酮糖激酶基因結合并導入釀酒酵母細胞，構建能同時利用葡萄糖和木糖的重組釀酒酵母。下左圖表示相關研究過程，右表是幾種限制性內切酶的識別序列及切割位點。請回答：

限制酶	識別序列和
切割位點
EcoRⅠ	G↓AATTC
BamHⅠ	G↓GATCC
HindⅢ	A↓AGCTT
XhoⅠ	C↓TCGAG
NdeⅠ	CA↓TATG
SalⅠ	G↓TCGAC

　　

(1)重組質粒中終止子的作用是____。表中切割DNA后形成相同黏性末端的限制性內切酶是____，黏性末端為____。

(2)過程③使用的限制性內切酶是________。過程⑤需先用LiAc處理釀酒酵母細胞，其目的是__________，使細胞處于能吸收環境中DNA的狀態。

(3)結合圖示分析，進行工程菌篩選時，在含四環素的培養基上長出的菌落不一定是導入重組質粒的釀酒酵母，這是因為____________。

(4)研究人員對篩選得到的兩種重組酵母(甲中導入啟動子A，乙中導入啟動子B)細胞中木酮糖激酶活力及發酵乙醇得率進行比較(發酵條件：1 L 15 g·L－1的葡萄糖和50 g·L－1的木糖培養基中，120 h)結果如下表。

從木酮糖激酶酶活力分析，可以得出的結論是啟動子A的功能比啟動子B____，但本實驗中乙醇得率相差不大，其可能的原因是___________________________________________。

Answer 1

【答案】使轉錄終止(或使RNA聚合酶與模板分離) XhoⅠ與SalⅠ —AGCT(或TCGA—) EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ 增大酵母細胞的通透性 普通質粒上有抗四環素基因，導入普通質粒的酵母也能在含四環素的培養基上生長繁殖 弱 實驗中發酵時間過長(或培養基中的葡萄糖和木糖含量過少)

【解析】

基因表達載體的組成：目的基因+啟動子+終止子+標記基因，其中啟動子是RNA聚合酶特異性識別和結合的DNA序列，是基因的一個組成部分，控制基因表達（轉錄）的起始時間和表達的程度；終止子是給予RNA聚合酶轉錄終止信號的DNA序列。

（1）重組質粒的組成成分包括啟動子、終止子、目的基因和標記基因，其中終止子的作用是使轉錄終止；根據表格分析，不同的限制酶識別和切割的位點不同，其中XhoⅠ與SalⅠ切割DNA后形成黏性末端是相同的，都是—AGCT(或TCGA—)。

（2）據圖分析，過程③含有啟動子A的目的基因兩側的限制酶切割位點是EcoRⅠ、BamHⅠ，且質粒上也有這兩種限制酶切割位點，而且沒有破壞標記基因，因此過程③使用的限制性內切酶是EcoRⅠ、BamHⅠ；過程⑤需先用LiAc處理釀酒酵母細胞，增大了酵母細胞的通透性，使細胞處于能吸收環境中DNA的狀態。

（3）由于重組質粒和普通質粒上都有抗四環素基因，則導入普通質粒的酵母和導入重組質粒的酵母菌都能在含四環素的培養基上生長繁殖，因此在含四環素的培養基上長出的菌落不一定是導入重組質粒的釀酒酵母。

（4）根據表格數據分析，重組釀酒酵母乙的木酮糖激酶酶活力遠遠高于重組釀酒酵母甲的木酮糖激酶酶活力，說明啟動子A的功能比啟動子B弱；但本實驗中乙醇得率相差不大，可能是因為實驗中發酵時間過長(或培養基中的葡萄糖和木糖含量過少)。