Question

【題目】鈣依賴蛋白激酶（CDPK）在植物的信號傳導和提高植物抗性方面發揮著重要作用，科學家通過將CDPK基因導入擬南芥中，來獲得具有抗性的新品種。下圖為某種質粒表達載體和含CDPK基因的DNA片段示意圖，圖中標記了限制酶的切割位點。回答下列問題：

（1）基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以從基因文庫中獲得。基因文庫包括___________________________。為了使CDPK基因插入質粒中，應選取________________兩種限制性核酸內切酶分別切割質粒和含目的基因的DNA片段。

（2）將獲取的CDPK基因進行PCR擴增，目前在PCR反應中使用Taq酶而不使用大腸桿菌DNA聚合酶的主要原因是________________________________________________。

（3）圖中所示的質粒為Ti質粒，操作過程中需要把CDFK基因插入到質粒的T-DNA片段中，T-DNA片段在轉化中的作用是______________________________________________。為了檢測CDPK基因是否導入成功，可以用________________________________作探針檢測CDPK基因是否導入擬南芥細胞，導入成功的標志是_________________________ 。

（4）為研究CDPK基因表達載體對擬南芥的遺傳轉化的影響，將轉化后的擬南芥植株生長成熟后，采集其種子，播種于含________________________的MS培養基中進行抗性篩選。

Answer 1

【答案】基因組文庫和cDNA文庫 Xbal和Small Taq酶熱穩定性高，而大腸桿菌DNA聚合酶在高溫下會失活 T-DNA片段能攜帶CDPK基因整合到受體細胞的染色體DNA上 放射性同位素標記的含有CDPK基因的DNA片段 顯示出雜交帶 卡那霉素

【解析】

分析題圖：CDPK基因為目的基因，卡那霉素抗性基因為標記基因。質粒上和含CDPK基因的DNA片段中含有的酶切位點相同，其中EcoRⅠ的識別位點位于質粒上的卡那霉素抗性基因的內部，HindIII的識別位點位于CDPK基因的內部。CDPK基因的左側有SmaⅠ與EcoRⅠ的識別位點，右側有Xbal I的識別位點。

(1) 基因文庫包括基因組文庫和cDNA文庫。分析題圖可知：質粒上和含CDPK基因的DNA片段中含有的酶切位點相同。CDPK基因為目的基因，卡那霉素抗性基因為標記基因。若使用EcoRⅠ切割，則會破壞質粒中的卡那霉素抗性基因；若使用HindIII切割，則會破壞CDPK基因。CDPK基因的兩端分別含有Xbal和SmalI的識別位點，若用Xbal和SmalI切割含CDPK基因的DNA片段和質粒，則能保持CDPK基因和卡那霉素抗性基因結構的完整性。所以為了使CDPK基因插入質粒中，應選取Xbal和Small兩種限制性核酸內切酶分別切割質粒和含目的基因的DNA片段。

(2) 利用PCR技術擴增CDPK基因（目的基因）的過程是在較高溫度下進行的，Taq酶熱穩定性高，而大腸桿菌DNA聚合酶在高溫下會失活，所以目前在PCR反應中使用Taq酶而不使用大腸桿菌DNA聚合酶。

(3) 質粒的T-DNA片段在轉化中的作用是：T-DNA片段能攜帶CDPK基因整合到受體細胞的染色體DNA上。檢測CDPK基因是否導入成功，應采用DNA分子雜交技術，在該技術中，需用放射性同位素標記的含有CDPK基因的DNA片段作探針。如果顯示出雜交帶，則標志著導入成功。

(4) 因此項基因工程中的標記基因為卡那霉素抗性基因，所以應將轉化后的擬南芥植株生長成熟后，采集其種子，播種于含卡那霉素的MS培養基中進行抗性篩選。