Question

【題目】蜘蛛絲中強度最好的牽引絲由主壺腹腺蛛絲蛋白（MaSp）組成。MaSp包括MaSp1、MaSp2兩個組分。完整的MaSp1蛋白可分NT、RP、CT三個部分。研究者以大腹園蛛MaSp1的NT等為研究對象做了相關實驗，以期了解大腹園蛛MaSp1的結構和成絲機理。實驗流程圖如圖所示。請回答問題：

（1）蜘蛛凍存之前通常要用滅菌蒸餾水清洗、饑餓等處理，其目的是______________；取凍存大腹園蛛的胸部組織搗碎，提取該蜘蛛的______________。

（2）在僅知黑寡婦蜘蛛和摩鹿加云斑蛛MaSp1基因編碼序列的情況下，研究者對比兩者NT中的氨基酸序列，根據其中共有的一段含有7個氨基酸的保守序列，推測對應的DNA序列，據此設計出長度為________個堿基的引物1。獲取該引物常用________方法。

（3）利用PCR技術擴增目的基因時，經25～30輪擴增循環后，由于模板的增多，________的數量會逐漸成為制約反應持續進行的主要限制性因素。

（4）流程圖中的空白處指構建________，然后將該結構導入________態的大腸桿菌。

（5）分離、純化NT蛋白時，為何不直接從培養液中提取，而是將表達該蛋白的工程菌破碎？_______________________________________

Answer 1

【答案】減少外源DNA的干擾 基因組DNA 21 化學方法（人工）合成 熱穩定DNA聚合酶（Taq酶） 基因表達載體（ 或重組質粒） 感受 大腸桿菌（缺少信號肽、內質網、高爾基體等）不分泌NT蛋白

【解析】

1、PCR技術的基本原理利用DNA體外雙鏈復制的原理，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的引物。

PCR由變性-退火-延伸三個基本反應步驟構成：①模板DNA的變性：模板DNA經加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；②模板DNA與引物的退火（復性）：模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；③引物的延伸：DNA模板-引物結合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基互補配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈，重復循環變性-退火-延伸三過程就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。

2、基因工程的操作步驟：提取目的基因、基因表達載體的構建、將目的基因導入受體細胞、目的基因的檢測與鑒定。

（1）蜘蛛凍存之前通常要用滅菌蒸餾水清洗、饑餓等處理，其目的是減少外源DNA的干擾，獲取目的基因的方法包括從自然界已有的物種中分離和人工合成法，因此取凍存大腹園蛛的胸部組織搗碎，可以從中提取該蜘蛛的基因組DNA。

（2）根據題意可知，研究者對比兩者NT中的氨基酸序列，根據其中共有的一段含有7個氨基酸的保守序列，推測對應的DNA序列，根據氨基酸與密碼子的對應關系可知，則設計出引物的長度為7×3=21個堿基的引物1，常用化學合成法合成引物。

（3）根據以上分析可知，PCR擴增過程中需要的條件為：模板、引物、熱穩定的DNA聚合酶、dNTP為反應原料等，因此經25～30輪擴增循環后，由于模板的增多，熱穩定DNA聚合酶的數量會逐漸成為制約反應持續進行的主要限制性因素。

（4）識圖分析可知，圖紙空白處為基因表達載體的構建，基因表達載體構建完成后導入受體細胞，大腸桿菌為微生物，可以用鈣離子轉化法處理，使大腸桿菌處于感受態，便于吸收周圍環境中的DNA分子。

（5）由于大腸桿菌為原核生物，沒有內質網、高爾基體等細胞器，不能對分泌蛋白進行加工和分泌，因此大腸桿菌不能分泌NT蛋白，故分離、純化NT蛋白時，不直接從培養液中提取，而是將表達該蛋白的工程菌破碎處理后提取。