Question

【題目】為了研究視神經病變誘導基因（OPTN）的分子機制，科研人員用OPTN基因的部分DNA片段構建表達載體，導入細胞后轉錄出的RNA會抑制細胞中OPTN蛋白的合成。實驗中使用的DNA片段和載體上限制酶的識別序列如下：

限制酶	BglⅡ	BamHⅠ	HindⅢ	XhoⅠ
識別序列和切割位點	A↓GATCT TCTAG↑A	G↓GATCC CCTAG↑G	A↓AGCTT TTCGA↑A	G↓TCGAG GAGCT↑C

請回答：

（1）應選用BamHⅠ和HindⅢ切割載體質粒，理由是____________。

（2）重組質粒上____________（填“有”或“無”）BamHⅠ的識別序列，因此可通過酶切法鑒定質粒是否重組成功，方法如下：用BamHⅠ和XhoⅠ兩種限制酶處理質粒，未重組的質粒將產生____________種片段，重組的質粒將產生____________種片段。

（3）重組質粒導入細胞后，能抑制細胞中OPTN蛋白合成的原因是____________。

（4）要證明導入重組質粒的細胞中OPTN基因的表達受到抑制，需要設置____________作為對照組。通常采用____________法檢測細胞中OPTN蛋白的表達水平。

Answer 1

【答案】目的基因片段和質粒上均含有HindⅢ的酶切位點；BamHⅠ與BglⅠ處理產生的黏性末端相同；BamHⅠ和HindⅢ處理質粒后能保證目的基因插入質粒的啟動子和終止子之間 無 2 1 重組質粒中OPTN基因部分片段轉錄產生的mRNA與細胞中指導OPTN蛋白合成的mRNA互補結合，阻礙了翻譯過程的進行 導入未重組質粒（和未導入質粒）的細胞 抗原—抗體雜交

【解析】

分析題圖可知，OPTN基因的部分片段上有限制酶BglⅡ和HindⅢ的酶切位點，質粒上有限制酶BamHⅠ、HindⅢ和XhoⅠ的酶切位點。一個基因表達載體必須包括目的基因、啟動子、終止子、標記基因等。啟動子是一段有特殊結構的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶識別和結合的部位，有了它才能驅動基因轉錄出mRNA，最終獲得所需蛋白質。終止子位于基因的尾端，使轉錄在所需的地方停止下來。

（1）由圖示可知，目的基因片段和質粒上均含有HindⅢ的酶切位點，由表格信息可知，限制酶BamHⅠ與BglⅠ切割后產生的黏性末端相同，由于目的基因需要插入到啟動子和終止子之間才能正常表達，因此選用限制酶BamHⅠ和HindⅢ切割質粒，用限制酶BglⅠ和HindⅢ切割目的基因后，能保證目的基因插入質粒的啟動子和終止子之間。

（2）由表格分析可知，質粒經過BamHⅠ切割后的黏性末端與目的基因上經BglⅡ切割后的黏性末端相連后的序列不能被BamHⅠ識別，即重組質粒上沒有BamHⅠ的識別位點，因此可通過酶切法鑒定質粒是否重組成功。若用BamHⅠ和XhoⅠ兩種限制酶處理質粒，未重組的質粒能被兩種限制酶切割，產生2種片段，重組質粒只能被XhoⅠ切割，產生1種片段。

（3）由于重組質粒中含有OPTN基因部分片段，因此當重組質粒導入細胞后，其上的OPTN基因部分片段轉錄出的mRNA能與細胞中指導OPTN蛋白合成的mRNA互補結合，阻礙了翻譯過程的進行，從而抑制細胞中OPTN蛋白的合成。

（4）要證明導入重組質粒的細胞中OPTN基因的表達受到抑制，需要設置導入未重組質粒（和未導入質粒）的細胞作為對照組。通常采用抗原—抗體雜交法檢測細胞中OPTN蛋白的表達水平，若無雜交帶出現，表明OPTN基因的表達受到抑制。