Question

【題目】抗凝血酶Ⅲ蛋白是一種血漿糖蛋白，臨床上主要用于血液性疾病的治療。凝乳酶是奶酪生產中的關鍵性酶。下列是生產這兩種酶的相關思路，請回答下列問題：

（1）圖1為通過培育轉基因奶牛獲得抗凝血酶Ⅲ蛋白的流程。

①圖中過程a指的是利用___________法將抗凝血酶Ⅲ蛋白基因導入受精卵。受體細胞不選用體細胞的理由是______________________。

②b為早期胚胎培養和胚胎移植，在胚胎移植前，需進行___________，目的是確定要培育的個體能產牛奶。

③可采用抗原-抗體雜交法來鑒定轉基因牛奶中是否含有抗凝血酶Ⅲ蛋白。該方法需要使用抗凝血酶Ⅲ蛋白的單克隆抗體，請寫出制備該抗體的實驗思路___________。

（2）從牛胃液中分離得到的凝乳酶以其催化能力強而被廣泛應用，研究人員運用基因工程技術，將編碼該酶的基因轉移到了微生物細胞中。

①從牛胃細胞中提取mRNA，再通過___________形成cDNA。以此cDNA為模板通過PCR擴增目的基因，有肘需要在引物的5’端設計___________（填“限制酶”/“DNA連接酶”/“RNA聚合酶”）的識別序列，以便構建重組DNA分子。

②為提高重組DNA分子的比例，在構建重組DNA分子（如圖2所示）時最好選用___________作限制酶。

③經研究發現，如果將該凝乳酶的第20位和24位氨基酸變為半胱氨酸，則其催化能力將提高2倍。現已知通過蛋白質工程可生產高效凝乳酶，應直接改造的是___________（凝乳酶蛋白/凝乳酶mRNA/凝乳酶基因）。

Answer 1

【答案】顯微注射 動物體細胞的全能型一般不能表現出來 性別鑒定 向小鼠體內注射現成的（標準的/純化后的）抗凝血酶Ⅲ蛋白；提取免疫小鼠的B淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合，經多次篩選獲得能產生特異性抗體的雜交瘤細胞；對雜交瘤細胞擴增培養獲取大量的單克隆抗體。 逆轉錄 限制酶 BamHⅠ和PstⅠ 凝乳酶基因

【解析】

（1）轉化的概念：是目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持穩定和表達的過程。常用的轉化方法：將目的基因導入植物細胞：采用最多的方法是農桿菌轉化法，其次還有基因槍法和花粉管通道法等。將目的基因導入動物細胞：最常用的方法是顯微注射法。此方法的受體細胞多是受精卵。（2）分析圖1，a為將目的基因導入受體細胞的過程，b為早期胚胎培養和胚胎移植。在切割目的基因和質粒時，用雙酶切可以防止自身環化和任意連接。

（1）①圖中過程a指的是利用顯微注射法將抗凝血酶III蛋白基因導入受精卵。由于動物體細胞的全能型一般不能表現出來，故受體細胞一般不選用體細胞。②需要將轉基因受體細胞培育成轉基因奶牛，只有母牛才能產奶，故在胚胎移植前，需進行性別鑒定，目的是確定要培育的個體能產奶。③制備抗凝血酶Ⅲ蛋白的單克隆抗體的過程是向小鼠體內注射現成的（標準的/純化后的）抗凝血酶Ⅲ蛋白；提取免疫小鼠的B淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合，經多次篩選獲得能產生特異性抗體的雜交瘤細胞；對雜交瘤細胞擴增培養獲取大量的單克隆抗體。

（2）①以提取的mRNA為模板，通過逆轉錄形成cDNA。而基因工程中需要用限制酶來切割DNA，因此在PCR擴增目的基因，有肘需要在引物的5’端設計限制酶的識別序列，以便構建重組DNA分子。②據圖可知，用BamHI和PstI雙酶切可有效避免質粒和目的基因自連，進而提高重組DNA的比例。③由于基因決定蛋白質，因此，要對蛋白質的結構進行設計改造，最終還必須通過基因來完成。故要通過蛋白質工程生產高效凝乳酶，應直接改造的是凝乳酶基因。