Question

【題目】許多大腸桿菌的質粒上含有lacZ基因，其編碼的產物β-半乳糖苷酶在X-gal和IPTG存在下，可以產生藍色沉淀，使菌落呈現藍色，否則菌落呈現白色。基因工程中常利用該原理從導入質粒的受體細胞中篩選出真正導入重組質粒的細胞，過程如下圖。請據圖回答：

（1）基因工程中，構建基因表達載體的目的是 。

（2）限制酶EcoRⅠ的識別序列和切點是—G↓AATTC—，SmaⅠ的識別序列和切點是—CCC↓GGG—。圖中目的基因被切割下來和質粒連接之前，需在目的基因的右側連接相應的末端，連接的末端序列是 ，連接過程中需要的基本工具是 。

（3）轉化過程中，大腸桿菌應先用 處理，使其處于能吸收周圍DNA的狀態。

（4）菌落的顏色為白色的是 ，原因是 。

（5）菌落③中的目的基因是否能表達，可采用的檢測辦法是 。

Answer 1

【答案】（1）使目的基因在受體細胞中穩定存在，能遺傳給后代，并表達和發揮作用

（2）-----TTAA DNA連接酶

（3）Ca2＋

（4）菌落③ lacZ標記基因區插入外源基因，不能表達出β-半乳糖苷酶，故菌落為白色

（5）抗原—抗體雜交

【解析】

試題分析：（1）基因工程的核心步驟是構建基因表達載體，目的是使目的基因在受體細胞中穩定存在，能遺傳給后代，并表達和發揮作用。

（2）由圖可知，目的基因的左側有限制酶EcoRI的識別序列，右側是限制酶SmaI的識別序列，而質粒上只有限制酶EcoRI的識別序列，所以需要用限制酶EcoRI來切割質粒，用限制酶EcoRI和SmaI來切割含有目的基因的外源DNA分子，這樣就使目的基因右側無法與質粒連接，所以目的基因被切割下來和質粒連接之前，需在目的基因的右側連接限制酶EcoRI切割形成的末端，即-TTAA，連接過程中需要DNA連接酶的催化。

（3）將目的基因導入大腸桿菌細胞之前，應先用Ca2+處理大腸桿菌，使其處于能吸收周圍DNA的感受態。

（4）用限制酶EcoRI切割質粒時，會破壞質粒上的lacZ'基因，但切割后的質粒自身環化后，lacZ'基因又被修復，能表達產生B-半乳糖苷酶，在X-gal和IPTG 存在下，可以產生藍色沉淀，使菌落呈現藍色，所以菌落①②呈現藍色；菌落③導入的是重組質粒，其lacZ'基因被破壞，不能表達產生B-半乳糖苷酶，在X-gal和IPTG存在下，菌落顏色為白色。

（5）檢測目的基因是否表達產生蛋白質，可采用抗原一抗體雜交法。