Question

【題目】黑胸大蠊是一種生活在我國南方地區的主要衛生害蟲，通過生物防治手段可以起到一定抑制蟲害的作用。某研究小組對黑胸大蠊濃核病毒的PfDNV基因與pUCl19質粒進行重組構建，通過感染黑胸大蠊研究其病理特征，已知KpnⅠ、PstⅠ、HindⅢ3種限制酶的酶切位點不同，Amp為氨芐青霉素抗性基因，實驗過程圖解如下。請分析回答下列問題：

（1）純化后的PfDNV基因可通過___________技術擴增。常將PfDNV基因與pUC119 質粒采取加G—C尾的連接方式構建重組質粒，該加尾的連接方式能使重組質粒的熱穩定性___________。

（2）研究小組將獲得的重組質粒通過___________法轉染大腸桿菌，在含有___________的培養基上培養一段時間后，挑選出部分菌株，用HindⅢ酶解菌株中的重組質粒，經電泳分析后發現有些菌株顯示有5kb和3.7kb片段，還有些菌株顯示有1.8kb和6.9kb片段，出現這種情況的原因是______________________。

（3）選擇可以正常表達的重組質粒PfDNV-pUCl19，利用KpnⅠ酶酶解后回收7.3kb的片段，通過_______的作用獲得PfΔKpn-pUC119重組質粒，將兩種重組質粒通過腹部注射法注入黑胸大蠊幼蟲體內，所得的結果如下表所示。

質粒轉染黑胸大蠊實驗結果

接種物	接種蟲數	感染蟲數	感染百分數（%）
PfΔKpn-pUC119
（2500ng）	20	20	100
（1250ng）	20	1S	90
（250ng）	20	17	85
PfAKpn-pUC119
（2300ng）	20	0	0
（1000ng）	20	0	0
野生型病毒	20	20	100
未接種	20	0	0

從上表中可以看出，當注射的重組質粒PfDNV-pUCl19的量在___________ng及以上時，蟲體最終死亡率與野生型病毒感染的結果—致。PfΔKpn-pUC119重組質粒注射幼蟲后沒有感染的根本原因是：KpnⅠ酶酶解后再連接，導致______________________。

Answer 1

【答案】 PCR 提高 感受態轉化（冰凍的氣化鈣溶液處理） 氨芐青霉素 基因和質粒的正向和反向連接 DNA連接酶 2500 PfDNV基因缺失了部分片段

【解析】試題分析：本題綜合考查學生對基因工程的知識的識記和理解能力。解答本題需熟記并理解基因工程的基本操作程序并形成清晰的知識網絡。在此基礎上，結合問題情境，從題圖和題意中提取有效信息，進行相關問題的解答。

(1)純化后的PfDNV基因可通過PCR技術擴增。常將PfDNV基因與pUC119 質粒采取加G—C尾的連接方式構建重組質粒，可使該“重組質粒”中的G—C堿基比例增加。DNA分子含有的氫鍵數越多，其結構越穩定，在每個DNA分子中，堿基對A與T之間有2個氫鍵，C與G之間有3個氫鍵，所以該加尾的連接方式能使重組質粒的熱穩定性提高。

(2)研究小組將獲得的重組質粒通過感受態轉化（冰凍的氯化鈣溶液處理）法轉染大腸桿菌。重組質粒含有的Amp為氨芐青霉素抗性基因，使其對氨芐青霉素有抗性。在含有氨芐青霉素的培養基上培養一段時間后，可將成功導入目的基因的菌株挑選出來。HindⅢ酶解菌株中的重組質粒，經電泳分析后發現有些菌株顯示有5kb和3.7kb片段，還有些菌株顯示有1.8kb和6.9kb片段，結合圖示分析可推知：出現這種情況的原因是基因和質粒的正向和反向連接。

(3)通過DNA連接酶可將KpnⅠ酶解后回收的7.3kb的片段連接，進而獲得PfΔKpn-pUC119重組質粒。分析表中信息可知：當注射的重組質粒PfDNV-pUCl19的量在2500 ng及以上時，蟲體最終死亡率與野生型病毒感染的結果—致。PfΔKpn-pUC119重組質粒注射幼蟲后沒有感染的根本原因是：KpnⅠ酶解后再連接，導致PfDNV基因缺失了部分片段。