Question

【題目】科研人員利用大腸桿菌構建了抗蟲基因文庫。最新研究發現漏斗蜘蛛中的AH基因控制合成的毒素肽具有顯著的殺蟲效果，現以p-B質粒為載體，構建AH基因的cDNA文庫。圖1表示p-B質粒，其中Cm!r表示氯霉素抗性基因，ccdB 基因表達產物能抑制大腸桿菌DNA復制。圖中箭頭表示相關限制酶的酶切位點，且不同種限制酶識別序列不同，其中Aiu I、Xba I、Ssp I和Mfe I識別的堿基序列和酶切位點分別是AGLCT、T4CTAGA、AATIATT、 CIAATTG。請分析回答：

（1）為獲得AH基因的cDNA，先要從漏斗蜘蛛毒素肽分泌細胞中提取_________， 再利用反應體系中添加__________， 從而準確合成出AH基因的cDNA，排除其他提取物的干擾。若從漏斗蜘蛛其他組織細胞提取，則難以成功，原因是其他組織細胞中_________。

（2）利用圖中的質粒和AH基因構建重組質粒時，宜選用________雙酶切質粒， 再選用_________切割目 的基因，將切割后獲得的DNA片段混合，經DNA連接酶處理后，再與大腸桿菌混合培養，在含有適量氯霉素的培養基中添加適量冷凍的________，以促進轉化。

（3）經上述處理培養后，獲得存活的大腸桿菌中應含有的質粒是________，原因是_________。

Answer 1

【答案】RNA 特異性引物 AH基因不表達 Aiu和MfeI SspI和MfeI CaCl2（或Ca2+） 重組質粒 重組質粒中的ccdB基因被破壞，不能抑制DNA復制

【解析】

基因工程技術的基本步驟：

（1）目的基因的獲取：方法有從基因文庫中獲取、利用PCR技術擴增和人工合成。

（2）基因表達載體的構建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等。

（3）將目的基因導入受體細胞：根據受體細胞不同，導入的方法也不一樣．將目的基因導入植物細胞的方法有農桿菌轉化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因導入動物細胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因導入微生物細胞的方法是感受態細胞法。

（4）目的基因的檢測與鑒定：

分子水平上的檢測：

①檢測轉基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術；

②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA--分子雜交技術；

③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質--抗原-抗體雜交技術。

個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

（1）cDNA是以RNA為模板逆轉錄而成的，因此為獲得AH基因的cDNA，先要從漏斗蜘蛛毒素肽分泌細胞中提取RNA，再利用反應體系中添加的特異性引物，從而準確合成出AH基因的cDNA，排除其他提取物的干擾。若從漏斗蜘蛛其他組織細胞提取，則難以成功，原因是存在基因的選擇性表達，其他組織細胞中AH基因不表達。

（2）質粒中含有多種限制酶識別序列，但用限制酶XbaI切割會破壞復制原點，因此不能用該酶切割；由于ccdB基因表達產物能抑制大腸桿菌DNA復制，因此構建基因表達載體時，應該破壞該基因，即需要用限制酶MfeI切割；若用Sph I和MfeI切割會導致啟動子丟失，因此不能用限制酶SphI切割；若用MfeI和SacI切割則不能獲取目的基因AH。綜合以上可知，利用圖中的質粒和AH基因構建重組質粒時，宜選用AiuI（產生平末端）和Mfel雙酶切質粒，再選用Sspl（產生平末端）和Mfel切割目的基因。將切割后獲得的DNA片段混合，經DNA連接酶處理后，再與大腸桿菌混合培養，在含有適量氯霉素的培養基中添加適量冷凍的CaCl2（或Ca2+），使受體細胞成為易于吸收周圍環境中DNA分子的感受態細胞，以促進轉化。

（3）由于重組質粒中的ccdB基因被破壞，不能抑制DNA復制，因此獲得的存活的大腸桿菌中應含有的質粒是重組質粒。