Question

【題目】P450是石油降解的關鍵酶，用SalⅠ和NdeⅠ聯合酶切獲得的P450基因，與下圖所示的質粒（pCom8）重組，導入土著菌種Y9，獲得了基因工程菌P450/Y9。圖中mel是黑色素合成基因，該基因表達能使白色的菌落變成黑色，aacCl是慶大霉素（一種抗生素）抗性基因，限制酶NdeⅠ、XhoⅠ和SspⅠ在該質粒上均只有一個酶切位點。下表表示幾種限制酶的識別序列和切割位點，據圖回答下列問題：

限制酶	SalⅠ	Nde Ⅰ	Xho Ⅰ	Ssp Ⅰ
識別序列及切割位點

（1）構建pCom8重組質粒時，需要用__________________________（限制酶）對圖示質粒進行處理，才能與__________________________在DNA連接酶的作用下形成重組質粒。基因工程中用兩種不同的限制酶切割目的基因和質粒，獲得不同的黏性末端的主要目的是防止_________________________和反向連接。

（2）為了擴增重組質粒，需將其轉入用__________預先處理的土著菌種Y9中，提高質粒導入率，以便獲得更多基因工程菌P450/Y9。為了篩選出轉入了重組質粒的基因工程菌P450/Y9，應在篩選平板培養基中添加______________。作為載體的質粒除了含有標記基因，還應該含有____________________（至少寫兩個）。

（3）為檢測基因工程菌降解石油能力的大小，可觀測的指標是____________________________。土著菌種Y9不能降解石油，但轉入上述構建好的表達載體后則獲得降解石油的能力，這是因為________________。

Answer 1

【答案】Nde Ⅰ、Xho Ⅰ 目的基因（或P450基因） 目的基因和質粒自身環化 Ca2+（或CaCl2） 慶大霉素 啟動子、終止子、復制原點 2天后（或一定時間后）樣品中石油的含量（剩余量） 基因工程菌P450/Y9能分泌降解石油的P450酶

【解析】

基因工程技術的基本步驟：

1、目的基因的獲取：方法有從基因文庫中獲取、利用PCR技術擴增和人工合成。

2、基因表達載體的構建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等。

3、將目的基因導入受體細胞：根據受體細胞不同，導入的方法也不一樣．將目的基因導入植物細胞的方法有農桿菌轉化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因導入動物細胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因導入微生物細胞的方法是感受態細胞法。

4、目的基因的檢測與鑒定：

（1）分子水平上的檢測：①檢測轉基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術；②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA--分子雜交技術；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質--抗原-抗體雜交技術。

（2）個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

（1）根據題干信息已知，切割目的基因的限制酶是SalⅠ和NdeⅠ，而SalⅠ切割質粒會破壞標記基因，又因為乙圖顯示SalⅠ和XhoⅠ切割后露出的黏性末端是相同的，因此可以用NdeⅠ、XhoⅠ切割質粒，然后與目的基因在DNA連接酶的作用下形成重組質粒。基因工程中用兩種不同的限制酶切割目的基因和質粒，獲得不同的黏性末端的主要目的是防止目的基因和質粒自身環化以及目的基因和質粒反向連接。

（2）為了擴增重組質粒，需將其轉入用Ca2+（或CaCl2）處理變得處于感受態的的微生物中。質粒中含有aacCl是慶大霉素（一種抗生素）抗性基因，因此在篩選出轉入了重組質粒的基因工程菌P450/Y9，應在篩選平板培養基中添加慶大霉素。作為載體的質粒一般具有啟動子、終止子、復制原點等條件。

（3）導入了目的基因P450基因的工程菌具備了降解石油的能力，可通過觀察一定時間后樣品中石油的含量來檢測該菌株降解石油的能力。土著菌種Y9不能降解石油，但轉入上述構建好的表達載體后，基因工程菌P450/Y9能分泌降解石油的P450酶，因而獲得了降解石油的能力。