Question

【題目】鋅指核酸酶（ZFN）是由鋅指蛋白（Zn）與核酸內切酶（FokI）組成的融合蛋白．每個FokI單體與3個鋅指蛋白單元相連，構建一個ZFN．通過3個Zn的組合可構建識別不同序列的ZFN．當2個ZFN的識別位點相距恰當的距離時，2個ZFN就形成二聚體產生酶切功能．圖1表示鋅指核酸酶的作用過程，其中虛線段之間為6個堿基對．

（1）據圖1分析，在鋅指核酸酶中，識別特定核酸位點的結構是_____，切斷相鄰核苷酸之間化學鍵的結構是_____．

（2）據圖1分析，一個ZFN單體能識別_____個堿基的特定序列，圖1中的2個ZFN單體識別的堿基序列_____（相同/不相同）．

雙鏈DNA分子中常存在4﹣8對堿基序列，呈旋轉對稱回文結構．不同的回文結構能被不同的限制酶識別并切割，如下表所示．回文序列也可通過構建相應的鋅指核酸酶進行切割．圖2為一段已知的堿基序列．

表：識別的回文序列及切割位點

限制酶	BamHⅠ	HindⅢ	EcoRⅠ	SmaⅠ
識別的回文序列及切割位點

（3）表中能夠對圖2序列進行切割的酶是__，并將該限制酶切割所產生的末端序列在下邊方框中補充完整___．若要得到相同的末端，所構建的ZFN在①鏈上的識別序列是_____（從左到右書寫）．

（4）理論上，通過不同鋅指蛋白單元的組合，ZFN可以酶切DNA片段上任意的部位．那么理論上一個鋅指蛋白單元有_____種，由其構成的ZFN有_____種．

Answer 1

【答案】鋅指蛋白 FokI 9 不相同 EcoR I ACG﹣TGC﹣CGA 64 643

【解析】

分析圖1：鋅指核酸酶（ZFN）是由3個鋅指蛋白（Zn）與1個核酸內切酶（FokI）組成的融合蛋白，每個鋅指蛋白能識別3個堿基，因此一個ZFN單體能識別9個堿基的特定序列；圖中左側ZFN單體識別的序列為GCG-GGT-GGG，而右側ZFN單體識別的序列為GCG-GGT-GCG，因此這2個ZFN單體識別的堿基序列不相同。

（1）由圖1可知，在鋅指核酸酶中，識別特定核酸位點的結構是鋅指蛋白，切斷相鄰核苷酸之間磷酸二酯鍵的結構是核酸內切酶（FokI）。

（2）由圖1可知，一個ZFN單體包括一個FokI單體與3個鋅指蛋白，其中每個鋅指蛋白能識別3個堿基，因此一個ZFN單體能識別9個堿基的特定序列；圖1中的2個ZFN單體識別的堿基序列不相同（左側ZFN單體識別的序列為GCG﹣GGT﹣GGG，而右側ZFN單體識別的序列為GCG﹣GGT﹣GCG）。

（3）對照圖2和表中四種限制酶的識別序列可知，表中能夠對圖2序列進行切割的酶只有EcoRI，由于EcoRI的識別序列為GAATTC∥CTTAAG，且切割位點在G和A之間，因此用該酶切割后產生的末端序列為．若要得到相同的末端，所構建的ZFN在①鏈上的識別序列是限制酶EcoRI的識別序列的后9個堿基序列，即ACG﹣TGC﹣CGA。

（4）一個鋅指蛋白單元對應3個堿基，每個ZFN有3個鋅指蛋白單元，因此理論上一個鋅指蛋白單元有4×4×4＝64種，由其構成的ZFN有64×64×64＝643種。