Question

【題目】為了檢測高原訓練對運動員體內的血紅蛋白含量的影響，需要對運動員訓練前后的血紅蛋白進行提取和分離，其步驟如下：

（1）在紅細胞的洗滌操作中，血液離心后結果如圖所示，其中血紅蛋白位于__________（填“上清液”或“沉淀物”）。洗滌紅細胞時，要用相當于紅細胞液體體積5倍的___________洗滌紅細胞3次，然后加入蒸餾水到原血液體積，再加40%的_____________，攪拌約10 min，使紅細胞破裂，釋放出血紅蛋白。

（2）在樣品粗分離操作中，將收集的血紅蛋白溶液放在透析袋中進行透析。透析的目的是_______________。

（3）血紅蛋白的純化是通過凝膠色譜法將雜蛋白除去，最后經___________電泳進行純度鑒定。研究小組用凝膠色譜法分離蛋白質時，相對分子質量___________（填“較大”或“較小”）的蛋白質先從層析柱中洗脫出來。在裝填色譜柱時不得有氣泡存在，原因是_______________________。

（4）檢測結果顯示，經過高原訓練后，運動員體內血紅蛋白含量有了明顯升高，試分析其可能的原因______________________。

Answer 1

【答案】沉淀物 生理鹽水 甲苯 去除分子量較小的雜質 SDS—聚丙烯酰胺凝膠 較大 氣泡會擾亂洗脫液中蛋白質的洗脫次序，使得到的紅色帶區歪曲、散亂，降低分離效果 高原環境空氣稀薄，氧氣含量低，血紅蛋白含量會增加

【解析】

根據蛋白質的物化理性質：形狀、大小、電荷性質和多少、溶解度、吸附性質、親和力等千差萬別，由此提取和分離各種蛋白質。血紅蛋白的提取與分離的實驗步驟主要有：（1）樣品處理：①紅細胞的洗滌（低速短時間離心），②血紅蛋白的釋放（需要加入蒸餾水和甲苯），③分離血紅蛋白（中速長時間離心）。（2）粗分離：①分離血紅蛋白溶液，②透析。（3）純化：調節緩沖液面→加入蛋白質樣品→調節緩沖液面→洗脫→收集分裝蛋白質。（4）純度鑒定--SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。凝膠色譜法（分配色譜法）：①原理：分子量大的分子通過多孔凝膠顆粒的間隙，路程短，流動快；分子量小的分子穿過多孔凝膠顆粒內部，路程長，流動慢。②凝膠材料：多孔性，多糖類化合物，如葡聚糖、瓊脂糖。③分離過程：混合物上柱→洗脫→大分子流動快、小分子流動慢→收集大分子→收集小分子。洗脫：從色譜柱上端不斷注入緩沖液，促使蛋白質分子的差速流動。④作用：分離蛋白質，測定生物大分子分子量，蛋白質的脫鹽等。

（1）血紅蛋白在紅細胞內，而血液離心后的各種血細胞主要存在于沉淀物中，因此血紅蛋白位于沉淀物中。洗滌紅細胞時，生理鹽水可以保持紅細胞不破裂，而5倍體積洗滌3次可以去除雜蛋白，得到更純的紅細胞。加入蒸餾水，紅細胞吸水破裂，加入40%的甲苯，溶解紅細胞膜，最終使紅細胞破裂，釋放出血紅蛋白。

（2）透析袋能使小分子自由進出，而大分子則保留在袋內，因此透析可以去除相對分子質量較小的雜質。

（3）血紅蛋白的純化是通過凝膠色譜法將雜蛋白除去，最后經SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳進行純度鑒定。分子量大的分子通過多孔凝膠顆粒的間隙，路程短，流動快；分子量小的分子穿過多孔凝膠顆粒內部，路程長，流動慢。因此，研究小組用凝膠色譜法分離蛋白質時，相對分子質量較大的蛋白質先從層析柱中洗脫出來。如果凝膠裝填得不夠緊密、均勻，就會在色譜柱內部形成無效的空隙，使本該進入凝膠內部的樣品分子從這些空隙中通過，攪亂洗脫液的流動次序，影響分離的效果，因此在裝填色譜柱時不得有氣泡存在。

（4）高原空氣稀薄，氧氣含量低，為了利用更多的氧氣進行有氧呼吸，運動員體內血紅蛋白含量有了明顯升高。