Question

【題目】隨著基因工程、細胞工程等現代生物科技的發展，人們生活中一些難以治愈的疾病有了一些新的治療手段，其中基因打靶是一項常用的技術手段。基因打靶技術是建立在基因同源重組技術以及胚胎干細胞技術的基礎上而發展起來的一種分子生物學技術。結合下圖回答下列問題：

注：neo＇是新霉素抗性基因；HSV-tK基因的表達可以使無毒的丙氧鳥苷代謝為毒性物質，導致細胞死亡。

（1）將目的基因和與細胞內靶基因同源的DNA片段都重組到質粒上，構建打靶載體（基因表達載體），該過程需要用到的工具酶有______________________。

（2）打靶載體測序驗證正確后，利用_________酶，將之線性化，以提高重組率。然后通過_______技術將其導入胚胎干細胞，這樣打靶載體與細胞內靶基因同源的區段就有概率發生同源重組。

（3）為了篩選發生同源重組的細胞，可在培養液中加入________進行初步篩選。最后還需要通過________技術鑒定同源重組的細胞（去除靶基因的細胞），將這樣的細胞通過擴大化培養后，獲得大量打靶成功的細胞。其中，暫時不用的細胞進行_____________保存。

（4）將打靶成功的細胞注射入小鼠囊胚，移植到同種、__________的母鼠體內，一段時間后對受體母鼠進行 ___________檢查，確保其生下嵌合小鼠。

Answer 1

【答案】 限制性內切酶和DNA連接酶 限制 顯微注射 新霉素和丙氧鳥苷 DNA分子雜交 液氮（或冷凍） 生理狀態相同（或經同期發情） 是否妊娠

【解析】本題考查基因工程和胚胎工程的操作步驟和流程，意在考察考生對中知識點的理解和應用能力。

（1）構建基因表達載體，需要用同種限制性內切酶對目的基因和運載體進行切割，然后用DNA連接酶將目的基因和運載體相連接。

（2）打靶載體測序驗證正確后，原來是環狀的，可以利用限制酶將其切開線性化。目的基因要導入動物細胞中需用顯微注射法。

（3）由圖可知重組后的DNA中含有新霉素抗性基因和但無HSV-tK基因，所以可在培養液中加入新霉素和丙氧鳥苷，如果細胞能存活下來，初步證明重組成功。需要進一步篩選需要用DNA分子雜交技術，可以確定看是否存在靶基因。對于暫時不用的細胞可以在液氮中進行冷凍保存。

（4）胚胎移植時，需要移植到同種、生理狀態相同的母鼠體內，可以用性激素進行同期發情處理得到。一段時間后對受體母鼠進行是否妊娠檢查，確保能生下嵌合小鼠。