Question

【題目】人類胰島素基因位于第11號染色體上，長度8416 bp，包含3個外顯子和2個內含子，人類胰島素的氨基酸序列已知。回答相關問題：

（1）上圖是利用PCR技術獲取人胰島素基因的方法，該過程在緩沖液中除了要添加模板和引物外，還需要添加的物質有_________，一個DNA分子經過5輪循環，需要引物A____個，從PCR的過程和DNA分子的特點，試著寫出設計引物需要注意的問題（答出2點即可）_____________________________________________。

（2）基因工程中需要DNA連接酶，根據酶的來源不同分為兩類，其中“縫合”雙鏈DNA片段平末端的是______________________，利用SDS-凝膠電泳分離不同DNA分子，遷移速度取決于____________________________。

（3）將獲得的胰島素基因導入大腸桿菌體內，一般先用_______處理大腸桿菌細胞，再將重組表達載體DNA分子溶于_________中與該類細胞混合，在一定溫度下促進細胞吸收DNA分子完成轉化過程。

（4）若利用圖示方法獲取的胰島素基因，直接構建基因表達載體后導入大腸桿菌，能不能表達出人胰島素，說明理由。___________________________________________。

Answer 1

【答案】四種脫氧核苷酸和熱穩定DNA聚合酶（Taq酶） 31 引物自身不能有互補序列、引物之間不能有互補序列、引物長度適當、引物能與目的基因兩側特異性結合、避免與擴增DNA內有過多互補的序列 T4DNA連接酶 DNA分子的大小 Ca2+ 緩沖液 不能，因為此方法獲得的目的基因中含有內含子，大腸桿菌無法正常識別內含子而對內含子部分轉錄的mRNA進行翻譯，所以合成的蛋白質會出現錯誤

【解析】

1、基因工程技術的基本步驟：（1）目的基因的獲取（2）基因表達載體的構建（3）將目的基因導入受體細胞（4）目的基因的檢測與鑒定。

2、采用PCR技術擴增DNA的過程為：變性、退火、延伸。

3、PCR技術的原理是模擬生物體內DNA分子復制的過程，利用DNA分子熱變形原理，通過控制溫度控制控制DNA分子的解聚和結合，DNA分子體內復制過程DNA的解旋是在解旋酶的作用下實現的；PCR擴增DNA片段過程最高經過n次擴增，形成的DNA分子數是2n個，其中只有2條單鏈不含有引物。

（1）用PCR技術擴增DNA時所需的條件：引物、模板DNA（目的基因或A基因）、原料（4種脫氧核糖核苷酸）和耐熱性的DNA聚合酶等。利用PCR技術擴增目的基因，此技術的前提是具有一段已知目的基因的核苷酸序列。根據PCR過程的特點可知，第一、二輪循環合成的子鏈長度均不同，根據半保留復制特點可知，前兩輪循環產生的四個DNA分子的兩條鏈均不等長，第三輪循環產生的DNA分子存在等長的兩條核苷酸鏈，即僅含引物之間的序列，因此，經過3輪循環可以得到所需的目的基因。循環5次，理論上至少需要26-2=62個引物，其中A引物31個。引物設計時需要注意以下幾點：引物自身不能有互補序列；引物之間不能有互補序列；引物長度適當；引物能與目的基因兩側特異性結合；避免與擴增DNA內有過多互補的序列。

（2）連接DNA片段平末端的酶是T4DNA連接酶。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳技術中分子的遷移速率主要取決于分子的大小，因此利用SDS-凝膠電泳分離不同DNA分子，遷移速度取決于DNA分子的大小。

（3）將人工合成的目的基因導入大腸桿菌體內，一般先用鈣離子處理大腸桿菌使之成為感受態細胞。再將重組DNA溶于緩沖液中與該類細胞融合，在一定溫度下促進細胞吸收重組DNA分子完成轉化過程。

（4）題干信息顯示圖示獲取的目的基因含有外顯子和內含子，因此直接將含有此目的基因的表達載體導入大腸桿菌并不能表達出胰島素，原因是大腸桿菌無法正常識別內含子而對內含子部分轉錄的mRNA進行翻譯，導致合成的蛋白質出現錯誤。