Question

【題目】科研人員用基因工程技術構建擬南芥突變體庫，并研究光信號（遠紅光）控制擬南芥種子萌發時下胚軸生長的分子機制。

（1）擬南芥突變體庫的構建過程如下。

①將插入了氨芐青霉素抗性基因的T-DNA與農桿菌在液體培養基中振蕩培養，獲得轉化液。將轉化液稀釋后對野生型擬南芥進行轉化，繼續培養擬南芥植株并收獲其種子，再將種子放入含有____________的培養基中培養篩選出能正常萌發的種子，命名為F1代種子, F1代種子因插入了含有氨芐青霉素抗性基因的T-DNA導致DNA分子發生了_____________這一分子結構上的變化。

②下面是利用F1種子構建純合突變體庫的流程圖。

將每株F1植株所結種子（F2代種子）單株存放，用①中的方法篩選F2代種子，表現為正常萌發和不能正常萌發比例約為____________時，F1植株為單拷貝插入（只有一個位點插入T-DNA）的雜合轉基因植株用同樣的方法篩選出單株F2。植株所結種子（F3代種子），若都能正常萌發，則F3植株為純合轉基因植株；F3自交得到F4代種子即為純合突變體庫。

（2）將上述突變體庫中的種子置于遠紅光條件下培養，挑選出擬南芥種子萌發時下胚軸明顯變長的甲、乙、丙三個突變體植株。

①將甲、乙、丙分別與野生型雜交，其后代種子在遠紅光下培養，萌發時均表現為下胚軸長度與野生型無明顯差異，說明3株突變均為___________突變。

②將甲和乙雜交得到種子在遠紅光下培養，萌發時下胚軸長度與甲和乙兩株相比均無明顯差異。請在圖畫出甲、乙突變基因與其以及對應的染色體的關系______（甲的基因用A或a、乙的基因用B或b表示）。

③將甲和丙雜交得到種子在遠紅光下培養，萌發時表現為________則可推測甲和丙的突變基因為非等位基因。

（3）科研人員還獲得了甲和丙的雙突變體，并在遠紅光條件下培養，測定其種子萌發時下胚軸的長度，結果如下圖。

有人提出了下面兩種種子萌發時基因調控下胚軸生長的示意圖（A、a表示甲的相關基因；D、d表示丙的相關基因）。

為驗證上述兩種推測是否正確，進行了下列實驗。

①已知A基因控制A蛋白的合成，D基因控制D蛋白的合成。研究發現遠紅光下，D蛋白進核后才能調控種子萌發時下胚軸的生長。將綠色熒光蛋白基因與D基因啟動子連接，分別轉入野生型和突變體甲，將其幼苗在黑暗處理4天，再在遠紅光處理30分鐘，發現兩種轉基因植株細胞核中均出現綠色熒光且強度無明顯差異。該實驗結果說明_____________________________

②分別提取黑暗條件和遠紅光條件下野生型和突變型甲的細胞質和細胞核蛋白，得到D蛋白的電泳結果如下圖。

上述結果表明，在遠紅光條件下，磷酸化D蛋白只在___________擬南芥植株的__________中大量積累，由此推測______________（圖1、圖2）更為合理。

Answer 1

【答案】氨芐青霉素 堿基對的增加 3：1 隱性 下胚軸長度與野生型無明顯差別 A蛋白不參與遠紅光條件下D蛋白向核內的轉移 野生型 細胞核 圖1

【解析】

1、Ti質粒上有一段特殊的DNA區段，當農桿菌侵染植物細胞時，該DNA區段能自發轉移，插入植物染色體DNA中，Ti質粒上的這一段能轉移的DNA被稱為T-DNA。根據這一現象，將Ti質粒進行改造，將相關基因置入T-DNA區段中，可通過農桿菌侵染細胞，實現外源基因對植物的遺傳轉化。利用農桿菌Ti質粒轉化植物細胞，是獲得植物突變體的一種重要方法；

2、含有氨芐青霉素抗性基因的擬南芥植株產生的種子，在含有氨芐青霉素的培養基中能正常萌發。光信號（遠紅光）對擬南芥種子萌發時下胚軸的長度有影響。

（1）①將氨芐青霉素抗性基因插入Ti質粒的T-DNA中，構建基因表達載體，即重組質粒，并導入農桿菌中。將轉化液稀釋后對野生型擬南芥進行轉化，繼續培養擬南芥植株并收獲其種子，再將種子放入含有氨芐青霉素的培養基中培養篩選出能正常萌發的種子，命名為F1代種子, F1代種子因插入了含有氨芐青霉素抗性基因的T-DNA導致基因突變，即DNA分子發生了堿基對的增加這一分子結構上的變化。

②F1植株為單拷貝插入（只有一個位點插入T-DNA）的雜合轉基因植株用同樣的方法篩選出單株F2。植株所結種子（F3代種子），若都能正常萌發，則F3植株為純合轉基因植株；F3自交得到F4代種子即為純合突變體庫。由于F1植株為雜合子,即突變型擬南芥（假設基因型為Aa）自交后代中，氨芐青霉素抗性（A_）：氨芐青霉素敏感（aa）=3:1，將每株F1植株所結種子（F2代種子）單株存放，用①中的方法篩選F2代種子，含有氨芐青霉素抗性基因的種子能夠正常萌發，因此，表現為正常萌發和不能正常萌發比例約為3:1。

（2）①基因突變分為顯性突變和隱性突變。將甲、乙、丙分別與野生型雜交，其后代種子在遠紅光下培養，萌發時均表現為下胚軸長度與野生型無明顯差異，說明野生型為顯性性狀， 3種突變均為隱性突變。

②甲和乙發生的均為隱性突變，將甲和乙雜交得到種子在遠紅光下培養，萌發時下胚軸長度與甲和乙兩株相比均無明顯差異，說明長度與甲、乙比，沒有區別，因此，是同一位點的基因突變。甲的基因用A或a、乙的基因用B或b表示，則甲突變個體是A突變為a，乙突變個體是B突變為b，甲、乙突變基因與其以及對應的染色體的關系如圖所示：

③將甲和丙雜交得到種子在遠紅光下培養，萌發時表現為下胚軸長度與野生型無明顯差異，說明甲丙突變的不是同一位點，則可推測甲和丙的突變基因為非等位基因。

（3）①經過前面的分析，突變體均為隱性突變，故野生型基因型為AADD，甲突變體的基因型為aaDD，丙突變體的基因型為AAdd，雙突變體的基因型為aadd。已知A基因控制A蛋白的合成，D基因控制D蛋白的合成。研究發現遠紅光下，D蛋白進核后才能調控種子萌發時下胚軸的生長。將綠色熒光蛋白基因與D基因啟動子連接，分別轉入野生型和突變體甲，將其幼苗在黑暗處理4天，再在遠紅光處理30分鐘，發現兩種轉基因植株細胞核中均出現綠色熒光且強度無明顯差異。野生型有A基因，即有A蛋白，甲無A基因，即無A蛋白，故自變量為A蛋白的有無，而兩者細胞核中均有綠色熒光，即兩者均有D蛋白向細胞核轉移，因此，該實驗結果說明A蛋白不參與遠紅光條件下D蛋白向核內的轉移。

②D蛋白的電泳結果圖表明，1代表磷酸化D蛋白，即為功能異常的D蛋白，2代表非磷酸化D蛋白，即為功能正常的D蛋白，在遠紅光條件下，野生型的細胞核中既有磷酸化D蛋白，又有非磷酸化D蛋白，而甲突變體aaDD的細胞核中只有正常功能的D蛋白，說明甲突變體aaDD抑制了D基因的磷酸化，因此，磷酸化D蛋白只在野生型擬南芥植株的細胞核中大量積累，由此推測圖1更為合理。