Question

【題目】在基因工程的操作過程中，有多種方法可檢測目的基因是否導入受體菌。回答下列問題：

（1）PCR檢測法：根據一段已知目的基因的核苷酸序列設計______________，對受體菌DNA進行擴增，經過解鏈、______________、延伸三個步驟的循環，檢測PCR產物的長度是否與目的基因一致。

（2）熒光蛋白基因篩選法：某種熒光蛋白（GFP）在紫外線照射下會發出綠色熒光。用_____________酶將目的基因和GFP基因拼接成融合基因，并與____________重組后導入受體菌，經培養篩選能發出綠色熒光的菌落。

（3）環絲氨酸輔助篩選法：四環素能使細菌停止生長但不致死；環絲氨酸能使正常生長的細菌致死，而對停止生長的細菌不致死。某質粒如圖所示（Ampr表示氨芐青霉素抗性基因，Tetr表示四環素抗性基因），Tetr中插入目的基因后失活。用此質粒構建表達載體，轉化細菌后，結果有3種：未轉化的細菌、含質粒的細菌、含重組質粒的細菌。

①用含有__________和____________的培養基對上述3種細菌進行篩選，只有含質粒的細菌被淘汰，理由是______________；

②在上述篩選的基礎上，若要篩選出含重組質粒的細菌，還需使用含有的______________培養基。

Answer 1

【答案】引物 復性（退火） DNA連接 運載體 四環素 環絲氨酸 含質粒的細菌有Tetr，四環素對其不起作用，環絲氨酸使其致死 氨芐青霉素

【解析】

PCR原理：在解旋酶作用下，打開DNA雙鏈，每條DNA單鏈作為母鏈，以4種游離脫氧核苷酸為原料，合成子鏈，在引物作用下，DNA聚合酶從引物3'端開始延伸DNA鏈，即DNA的合成方向是從子鏈的5'端自3'端延伸的，DNA的復制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能從3′端延伸DNA鏈，PCR反應過程是：變性→復性→延伸。基因工程操作中要用到限制酶、DNA連接酶、載體，限制酶能夠識別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷裂，DNA連接酶用于連接目的基因和載體；根據質粒圖顯示，質粒中含有Ampr和Tetr，目的基因的插入位點位于Tetr中，轉化細菌后有3種結果：未轉化的細菌、含質粒的細菌、含重組質粒的細菌，其中未轉化的細菌在含四環素的培養基上停止生長，含質粒的細菌在四環素和氨芐青霉素培養基上能生長，含重組質粒的細菌在含四環素的培養基上停止生長，但在含氨芐青霉素的培養基上能生長。

（1）PCR全稱為聚合酶鏈式反應，是一項在生物體外復制特定的DNA片段的核酸合成技術，前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據這一序列合成引物；對受體菌DNA進行擴增，經過解鏈、復性、延伸三個步驟的循環，檢測PCR產物的長度是否與目的基因一致。

（2）熒光蛋白基因篩選法：某種熒光蛋白（GFP）在紫外線照射下會發出綠色熒光。用DNA連接酶將目的基因和GFP基因拼接成融合基因，并與運載體重組后導入受體菌，經培養篩選能發出綠色熒光的菌落。

（3）①用含有四環素和環絲氨酸的培養基對上述3種細菌進行篩選，只有含質粒的細菌被淘汰，原因是含質粒的細菌有Tetr，四環素對其不起作用，能正常生長，而環絲氨酸能使其致死。

②四環素能使細菌停止生長但不致死，環絲氨酸能使正常生長的細菌致死，而對停止生長的細菌不致死，先在含有四環素和環絲氨酸的培養基上篩選出未轉化的細菌和含重組質粒的細菌，未轉化的細菌在含四環素培養基上停止生長，環絲氨酸不使其致死，含重組質粒的細菌由于四環素抗性基因被破壞，故在含四環素培養基上停止生長，而環絲氨酸對其不致死，重組質粒在含氨芐青霉素的培養基上能生長，若要篩選出含重組質粒的細菌，還需使用含有的氨芐青霉素培養基。