Question

【題目】圖甲為構建重組質粒過程中的三種備選質粒，其中Ap為氨芐青霉素抗性基因，Tc為四環(huán)素抗性基因。圖乙為培育轉AFPs基因(抗凍基因)番茄的示意圖，外源DNA和質粒上均標出了酶切位點及相關抗性基因，請回答下列問題。

(1)圖甲中通常選用質粒C構建重組質粒，而不選用質粒A或質粒B的原因分別是______________________。

(2)據(jù)圖乙分析，若需使用插入滅活法篩選并鑒定重組質粒，應優(yōu)先選用限制酶________切割目的基因和質粒。

(3)通過PCR技術獲取目的基因時需設計________種引物；從cDNA文庫中獲得的目的基因________(填“含有”或“不含有”)啟動子和終止子。

(4)在構建基因表達載體過程中常把兩個啟動子串聯(lián)在一起形成雙啟動子，加在目的基因上游。雙啟動子的作用可能是________。

(5)圖乙農(nóng)桿菌中的質粒應含有T－DNA，其作用是________。若要獲得抗凍能力更強的抗凍番茄，可以對AFPs基因進行改造，最終得到相應的蛋白質，該過程需用到____________工程。

(6)為使改造后的AFPs基因能夠表達，人工設計質粒D并對它的多個酶切位點進行研究。若用HindⅢ酶或KpnⅠ酶單獨切割質粒D，均獲得一條長鏈，若用HindⅢ酶和EcoRⅠ酶同時切割，則獲得2個500bp和1個2666bp片段，若用KpnⅠ酶和EcoRⅠ酶同時切割，則獲得2個250bp和1個3166bp片段。若以HindⅢ酶切割位點為計算起點，則KpnⅠ酶切割位點與HindⅢ酶切割位點最短長度為________，EcoRⅠ酶的兩個切割位點與HindⅢ切割位點的最短距離為________。

Answer 1

【答案】質粒A中沒有標記基因，質粒B的復制原點中含有HindⅢ酶切位點 BamHⅠ和HindⅢ 2 不含有 保證目的基因的高效轉錄(高效表達) 攜帶目的基因進入番茄細胞并整合到番茄細胞的染色體DNA 蛋白質 750bp 500bp

【解析】

基因工程的操作步驟：目的基因的獲取、構建基因表達載體、把目的基因導入受體細胞、目的基因的檢測和鑒定。

（1）質粒A缺乏標記基因，質粒B的復制原點中含有限制酶切割位點，可能會破壞復制原點，質粒C含有多個標記基因和酶切位點，適宜作為基因工程的載體。

（2）圖乙中，選用的質粒C作為基因工程的載體，結合目的基因兩端的酶切位點，目的基因和載體可以選擇BamHⅠ和HindⅢ同時切割，或者EcoRⅠ和HindⅢ同時切割，若需使用插入滅活法篩選并鑒定重組質粒，應優(yōu)先選用限制酶BamHⅠ（會破壞Tc）和HindⅢ切割，可以根據(jù)是否對四環(huán)素有抗性來篩選。

（3）啟動子是RNA聚合酶結合的位點，是起始轉錄的位點，雙啟動子可能是為了高效轉錄。

（4）農(nóng)桿菌轉化法中的Ti質粒含有的T-DNA可以攜帶目的基因進入番茄細胞并整合到番茄細胞的染色體DNA上。對AFPs基因進行改造，進而達到改造獲得抗凍能力更強的抗凍番茄，需要通過蛋白質工程實現(xiàn)。

（5）若用HindⅢ酶或KpnⅠ酶單獨切割質粒D，均獲得一條長鏈，說明該質粒上只含有HindⅢ酶的一個酶切位點和KpnⅠ酶的一個酶切位點；若用HindⅢ酶和EcoRⅠ酶同時切割，則獲得2個500bp和1個2666bp片段，若用KpnⅠ酶和EcoRⅠ酶同時切割，則獲得2個250bp和1個3166bp片段。說明EcoRⅠ酶有2個酶切位點，且兩個位點之間的最短距離是500bp，而KpnⅠ酶的切點在2個EcoRⅠ酶切點之間，距離每個EcoRⅠ酶切點250bp，HindⅢ酶切點距離最近的EcoRⅠ酶切點的最短距離是500bp，距離另一個EcoRⅠ酶切點的距離是500+500=1000 bp。故KpnⅠ酶切割位點與HindⅢ酶切割位點最短長度為250+500=750 bp，EcoRⅠ酶的兩個切割位點與HindⅢ切割位點的最短距離為500bp。