Question

【題目】為生產(chǎn)具有特定性能的α-淀粉酶，研究人員從某種海洋細(xì)菌中克隆了α-淀粉酶基因（1656個(gè)堿基對(duì)），利用基因工程大量制備α-淀粉酶，實(shí)驗(yàn)流程見下圖。請(qǐng)回答下列問題：

（1）獲取α-淀粉酶基因后，對(duì)其進(jìn)行克隆常采用的技術(shù)是_________。

（2）為了便于擴(kuò)增的DNA片段與表達(dá)載體連接，需在引物的_______端（填5’或3’）加上限制性酶切位點(diǎn)，且常在兩條引物上設(shè)計(jì)加入不同的限制性酶切位點(diǎn)，主要目的是_______________

（3）進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，反應(yīng)的溫度和時(shí)間需根據(jù)具體情況進(jìn)行設(shè)定，下列選項(xiàng)中________的設(shè)定與引物有關(guān)，________的設(shè)定與擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度有關(guān)。（填序號(hào)）

①變性溫度 ②退火溫度 ③延伸溫度 ④變性時(shí)間 ⑤退火時(shí)間 ⑥延伸時(shí)間

（4）下圖表示篩選獲得的工程菌中編碼α-淀粉酶的mRNA的部分堿基序列：

圖中虛線框內(nèi)mRNA片段包含______個(gè)密碼子，如虛線框后的序列未知，預(yù)測(cè)虛線框后的第一個(gè)密碼子最多有_______ 種。

（5）獲得工程菌表達(dá)的α-淀粉酶后，為探究影響酶活性的因素，以濃度為1%的可溶性淀粉為底物測(cè)定酶活性，結(jié)果如下：

緩沖液	50 mmol/L Na2HPO4-KH2PO4				50 mmol/L Tris-HCl				50 mmol/L Gly-NaOH
pH	6.0	6.5	7.0	7.5	7.5	8.0	8.5	9.0		9.0	9.5	10.0	10.5
酶相對(duì)活性%	25.4	40.2	49.8	63.2	70.1	95.5	99.5	85.3		68.1	63.7	41.5	20.8

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，初步判斷該α-淀粉酶活性最高的條件為_________________________ 。

Answer 1

【答案】PCR 5’ 使DNA片段能定向插入表達(dá)載體，并減少自連 ② ⑥ 8 13 pH為8.5，緩沖液為50 mmol/L Tris-HCl

【解析】

圖示為基因工程操作過程：①目的基因（α-淀粉酶基因）和表達(dá)載體的制備，②目的基因和表達(dá)載體構(gòu)成重組DNA分子，③重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞，④目的基因的篩選和鑒定。

（1）PCR是常用的體外擴(kuò)增技術(shù)，能將微量的α-淀粉酶基因大幅增加。

（2）因延伸是在引物的3’端進(jìn)行，因此需要在5’端加上限制性酶切位點(diǎn)，為使DNA片段能定向插入表達(dá)載體，并減少自連，通常需要在兩條引物上設(shè)計(jì)加入不同的限制性酶切位點(diǎn)。

（3）進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，②退火溫度促進(jìn)引物與該模板DNA單鏈重新配對(duì)，⑥延伸時(shí)間與擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度有關(guān)。

（4）mRNA分子三個(gè)相鄰的堿基稱為一個(gè)密碼子，虛線框內(nèi)mRNA片段包含24個(gè)堿基，8個(gè)密碼子，線框后的第一個(gè)堿基是U，第二、三位的堿基都有4種可能性，因此共有44=16種密碼子，因不可能是3種終止密碼子，虛線框后的第一個(gè)密碼子最多有16-3=13種。

（5）依圖可知：在pH為8.5，緩沖液為50 mmol/L Tris-HCl的條件下，α-淀粉酶相對(duì)活性最高。