Question

【題目】（下面是將乙肝病毒表面主蛋白基因HBsAg導入巴斯德畢赤酵母菌生產乙肝疫苗的過程圖。巴斯德畢赤酵母菌是一種甲基營養型酵母，能將甲醇作為其唯一碳源。該酵母菌體內無天然質粒，科學家改造出了圖1所示的pPIC9K質粒用作載體，其與目的基因形成的重組質粒經酶切后可以與酵母菌染色體發生同源重組，將目的基因整合于染色體中以實現表達。已知當甲醇作為唯一碳源時，該酵母菌中AOX1基因受到誘導而表達（5A0X1和3AOX1（TT）分別是基因AOX1的啟動子和終止子）。請分析回答：

（1）為實現HBsAg基因和pPIC9K質粒重組，應該選擇______切割質粒，并在HBsAg基因兩側的A和B位置接上______，這樣設計的優點是______。

（2）酶切獲取HBsAg基因后，需用______將其連接到pPIC9K質粒上，形成重組質粒，并將其導入大腸桿菌以獲取______。

（3）步驟3中應選用限制酶______來切割重組質粒以獲得重組DNA，然后再將其導入巴斯德畢赤酵母菌細胞。

（4）為了確認巴斯德畢赤酵母菌轉化是否成功，在培養基中應該加入______以便篩選；若要檢測轉化后的細胞中是否含有HBsAg基因轉錄產物，可以用______方法進行檢測。

（5）轉化的酵母菌在培養基上培養一段時間后，需要向其中加入______以維持其生活，同時誘導HBSAg基因表達。

Answer 1

【答案】SnaB I、Avr Ⅱ 相應的限制酶識別序列 確保定向連接（避免質粒和目的基因自身環化及自連） DNA連接酶 大量重組質粒 BgIⅡ 卡拉霉素 分子雜交 甲醇

【解析】

分析題圖該題考查基因工程的基本操作程序，結合題圖及題干信息，綜合運用所學知識逐項作答。

（1）分析題圖：SnaB、AvrⅡ、BglⅡ和SacI限制酶切割位點，其中SacI位于啟動子上，BglⅡ位于終止子上。為實現HBsAg基因和pPIC9K質粒重組，只能用限制酶SnaB和AvrⅡ切割質粒，并在HBsAg基因兩側的A和B位置接上相應的限制酶識別序列，這樣設計的優點是確保定向連接（避免質粒和目的基因自身環化及自連）。

（2）酶切獲取HBsAg基因后，需用DNA連接酶將其連接到pPIC9K質粒上，形成重組質粒，并將其導入大腸桿菌以獲取大量重組質粒。

（3）結合（1），步驟3中應選用限制酶BgIⅡ來切割重組質粒以獲得重組DNA，然后再將其導入巴斯德畢赤酵母菌細胞。

（4）5′AOX1--3′AOX1段基因含有卡拉霉素抗性基因，為了確認巴斯德畢赤酵母菌轉化是否成功，在培養基中應該加入卡拉霉素以便篩選；若要檢測轉化后的細胞中是否含有HBsAg基因轉錄產物，可以用分子雜交方法進行檢測。

（5）轉化的酵母菌在培養基上培養一段時間后，需要向其中加入甲醇以維持其生活，同時誘導HBSAg基因表達。