Question

【題目】下圖為某種質粒表達載體簡圖，小箭頭所指分別為限制性內切酶EcoRI、BamHI的酶切位點，ampR為青霉素抗性基因，tetR為四環素抗性基因，P為啟動子，T為終止子，ori為復制原點。已知目的基因的兩端分別有包括EcoRI、BamHI在內的多種酶的酶切位點。

據圖回答：

（1）將含有目的基因的DNA與質粒表達載體分別用EcoRI 酶切，酶切產物用DNA連接酶進行連接后，其中由兩個DNA片段之間連接形成的產物有_______________、_____________、__________三種。若 要從這些連接產物中分離出重組質粒，需要對這些連接產物進行____________。

（2）用上述3種連接產物與無任何抗藥性的原核宿主細胞進行轉化實驗。之后將這些宿主細胞接種到含四環素的培養基中，能生長的原核宿主細胞所含有的連接產物是_________；若接種到含青霉素的培養基中，能生長的原核宿主細胞所含有的連接產物是_________。

（3）目的基因表達時，RNA聚合酶識別和結合的位點是_________，其合成的產物是_________。

（4）在上述實驗中，為了防止目的基因和質粒表達載體在酶切后產生的末端發生任意連接，酶切時應選用的酶是_______。

Answer 1

【答案】目的基因—載體連接物 載體—載體連接物 目的基因—目的基因連接物 分離純化 載體—載體連接物 目的基因—載體連接物、載體—載體連接物 啟動子 mRNA EcoRI和BamHI

【解析】

用上述兩種限制酶同時切割目的基因后，目的基因的兩個黏性末端不同，這樣目的基因就不會自連成環狀。同樣用上述兩種限制酶同時切割質粒后，質粒的兩個黏性末端也不同，這樣質粒也不會自連。這樣當把切割后目的基因和切割后質�；旌虾�，只有目的基因和質粒才能相連。產物中只有重組質粒，而無其他的連接產物。

（1）用EcoRI酶切出的目的基因和質粒具有相同的黏性末端，如果放在一起加入DNA連接酶，則可出現三種連接結果，即會出現目的基因自身形成的連接物，載體自身形成的連接物和重組質粒，要通過篩選、純化才能選出符合要求的DNA。

（2）載體自身形成的連接物能重新形成完整的tetR基因，具有抗四環素的特點，其他連接物中tetR基因被限制性內切酶破壞，不再具有抗四環素的特點；在整個操作過程中，ampR基因保持完整，質粒自身形成的連接物和重組質粒都具有抗青霉素的特性。

（3）RNA聚合酶與相關基因的啟動子結合，完成的是轉錄過程。

（4）將含有目的基因的靶DNA片段和載體分別用兩個不同的限制性內切酶切割，使兩種DNA片段自身的5′和3′黏性末端不同，但二者相同末端又互補，這明顯減少靶DNA片段和載體自身環化與串連，使外源DNA片段能正確插入載體啟動子下游。在本題中目的基因兩端有EcoRI酶切點和BamHI酶切點，在質粒載體上也有這兩種酶的切點，所以可以用這兩種酶切出非同源性互補末端來阻止其他連接。