Question

【題目】Hedgehog基因（H）廣泛存在于無脊椎動物和脊椎動物中，在胚胎發育中起重 要作用。我國科研工作者利用基因敲除和核酸分子雜交技術，研究了H基因在文昌魚 胚胎發育中的作用。

（1）研究者使用了兩種TALE蛋白對文昌魚的H基因進行敲除。TALE蛋白的結構是人工 設計的，蛋白質的中央區能夠結合H基因上特定的序列，F區則能在該序列處將DNA雙鏈切開如圖1所示。

①根據_______設計出其氨基酸序列，再根據氨基酸序列對應的密碼子序列推測岀編碼 TALE蛋白的DNA序列，人工合成DNA序列之后，再以其為模板進行轉錄生成 mRNA。

②將兩種mRNA用 _______法導入文昌魚的卵細胞中，然后滴加精液使卵受精，此受精 卵發育成的個體為F0代。

③F0代個體細胞內被兩種TALE蛋白處理過的DNA，經________催化重新連接后，H 基因很可能因發生堿基對的_______而喪失功能，基因喪失功能則被稱為“敲除”。

（2）提取F0代胚胎細胞DNA，通過________體外擴增H基因，用________進行切割，電 泳后用______為探針進行DNA分子雜交，實驗結果如圖2所示。圖中樣品________代表的F0個體中部分H基因己被敲除。研究者發現，在F0個體產生的所有配子中，通常只有部分配子的H基因被敲除，可能的原因是__________。

Answer 1

【答案】TALE蛋白的功能 顯微注射 DNA連接酶 缺失 PCR技術 BsrGⅠ酶 放射性同位素（或熒光）標記的目的基因片段 2 F0受精卵中成對的H基因中僅一個被敲除（F0胚胎中僅部分細胞的H基因被敲除、細胞中H基因未被敲除）

【解析】

分析圖1：被兩種TALE蛋白處理過的DNA重新連接后，缺失了BsrGⅠ識別位點。

分析圖2：H基因中含有一個BsrGⅠ識別位點，能被BsrGⅠ切割形成兩種不同長度的DNA片段，而H基因被敲除后會缺失BsrGⅠ識別位點，不能被BsrGⅠ識別和切割。樣品1中有兩種長度不同的DNA，說明其代表的個體中H基因沒有被敲除，樣品2中含有3種長度不同的DNA片段，說明其代表的F0個體中部分H基因已被敲除。

（1）①蛋白質工程的基本程序：預期蛋白質功能→設計預期的蛋白質結構→推測應有氨基酸序列→找到對應的脫氧核苷酸序列（基因）。因此人工設計TALE蛋白時，應該先根據TALE蛋白的功能設計出其氨基酸序列，再根據氨基酸序列對應的密碼子（mRNA）序列推測出編碼TALE蛋白的DNA序列，人工合成DNA序列之后，再以其為模板進行轉錄生成mRNA。

②將兩種mRNA導入動物細胞（文昌魚的卵細胞）最有效的方法是顯微注射法。

③由圖可知，被兩種TALE蛋白處理過的DNA經過DNA連接酶重新連接后，缺失了BsrGⅠ識別位點，即發生堿基對的缺失，H基因很有可能因此而喪失功能，基因喪失功能則被稱為“敲除”。

（2）體外擴增目的基因可采用PCR技術；H基因中含有一個BsrGⅠ識別位點，因此可用BsrGⅠ酶切割H基因；探針是指放射性同位素（或熒光）標記的目的基因片段；樣品1中有兩種長度不同的DNA，說明其代表的個體中H基因沒有被敲除，樣品2中含有3種長度不同的DNA片段，說明其代表的F0個體中部分H基因已被敲除。在F0個體產生的所有配子中，通常只有部分配子的H基因被敲除，可能的原因是F0受精卵中成對的H基因中僅一個被敲除（F0胚胎中僅部分細胞的H基因被敲除、細胞中H基因未被敲除）。