Question

【題目】科研人員利用胚胎干細胞(ES細胞)對于擾素基因缺失小鼠進行基因治療，其技術流程如圖1：

(1)步驟①中，在核移植前應去除卵母細胞的______________________，常用的導入目的基因的方法為______________________。

(2)將基因導入ES細胞而不是導入到上皮細胞是因為______________________。

(3)步驟③中，需要構建含有干擾素基因的______________________。已知DNA分子復制過程中，子鏈延伸的方向是從5′端→3′端，構建前利用PCR技術擴增干擾素基因時，可以從圖2中A、B、C、D四種單鏈DNA片段中選取______________________作為引物。對干擾素基因片段和質粒進行酶切時，可選用限制酶的組合為______________________。

(4)將步驟③獲得的ES細胞在熒光顯微鏡下觀察，選擇發___________色熒光的細胞進行體外誘導。為檢測干擾素基因是否表達，可以采用______________________的方法。

Answer 1

【答案】細胞核 顯微注射法 ES細胞具有發育的全能性（或經誘導可發育為各種組織、器官或細胞） 基因表達載體 B和C Hind Ⅲ和Pst Ⅰ（或EcoR Ⅰ和Pst Ⅰ） 綠 抗原——抗體雜交

【解析】

本題以基因治療的流程圖為載體，考查了基因工程、細胞工程以及胚胎工程等方面的知識，難度適中。考生要能夠識記細胞核移植的過程；識記囊胚包括內細胞團和滋養層兩部分；明確基因工程中質粒和目的基因需要利用同種限制酶進行切割；掌握目的基因檢測和鑒定的一般方法等。

分析圖1：圖示是利用胚胎干細胞（ES細胞）對干擾素基因缺失小鼠進行基因治療的流程，其中①表示通過核移植技術獲得重組胚胎的過程；②表示早期胚胎培養過程；③表示采用基因工程技術將目的基因導入受體細胞的過程。

分析圖2：該DNA片段含有四種限制酶識別序列和切割位點，其中SamⅠ酶的識別序列和切割位點位于目的基因上。

分析圖3：圖3為質粒結構示意圖，該質粒含有2個標記基因（紅色熒光標記基因和綠色熒光標記基因）。

(1)①表示通過核移植技術獲得重組胚胎的過程；核移植前要先用顯微操作的方法去除卵母細胞的細胞核，并將第一極體也一并除去；導入目的基因進入動物細胞常用顯微注射法。

(2)從囊胚的內細胞團中分離出來的ES細胞具有發育的全能性，可發育為各種組織、器官或細胞，所以將基因導入ES細胞。

（3）步驟③是將目的基因導入ES細胞，該過程之前需要構建基因表達載體；DNA復制只能從5’到3’，因此構建前利用PCR技術擴增干擾素基因時，可以從圖2中A、B、C、D四種單鏈DNA片段中選取B和C作為引物。由圖可知，SamⅠ酶的識別序列和切割位點位于目的基因上，用該酶切割會破壞目的基因，因此對干擾素基因片段和質粒進行酶切時，可選用限制酶HindⅢ和PstⅠ或EcoRⅠ和PstⅠ。
（4）用限制酶HindⅢ和PstⅠ或EcoRⅠ和PstⅠ切割時會破壞紅色熒光蛋白基因，但不會破壞綠色熒光蛋白基因，因此將步驟③獲得的ES細胞在熒光顯微鏡下觀察，選擇發綠色熒光的細胞進行體外誘導。為檢測干擾素基因是否表達，可以采用抗原-抗體雜交法檢測目的基因是否翻譯出相應的蛋白質。