Question

【題目】pBV220載體是我國預防醫學科學院病毒研究所自行構建并廣泛應用的大腸桿菌溫控載體，大小為3 666 bp（bp表示堿基對），其結構如下圖所示。圖中PRPL是啟動子，rrB是基因轉錄終止信號，Ampr是氨芐抗性基因，ori是質粒復制起點，EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ等為各種限制性內切酶。請據圖回答下列有關問題：

（1）基因工程的核心步驟是____________________________________。

（2）從圖中可看出，pBV220作為運載體具備的條件有________、________。

（3）該質粒可被A、B、C三種限制性內切酶同時切割。單獨A切割得一條長鏈，單獨B切也得一條長鏈，A和C同時切割得2個500 bp和1個2 666 bp片段，B和C同時切割得2個250 bp和1個3 166 bp片段。若以A的切割位點為計算起點，則B的切割位點與A點最短長度為________，C的兩個切割位點與A點的最短距離分別為________、________

（4）PR和PL都是啟動子，pBV220載體構建過程中把兩個啟動子串聯在一起，形成了雙啟動子，雙啟動子的作用可能是________。溫控基因CIts857編碼對溫度敏感的CIts蛋白，CIts在30℃時具有抑制啟動子的活性，在42℃時失活。促進工程菌目的基因表達的誘導溫度為________。

Answer 1

【答案】 構建目的基因的表達載體 多個限制性內切酶的切割位點 標記基因 750 bp 500 bp 1 000 bp 保證目的基因的高水平表達（高效轉錄） 42℃

【解析】本題考查基因工程，要求考生理解基因工程的操作程序，明確運載體必需具備的條件，能根據題意計算質粒中的不同的酶切位點的位置關系，進而分析、解答問題。

（1）基因工程的核心步驟是構建目的基因的表達載體。

（2）從圖中可看出，pBV220作為運載體具備的條件有多個限制性內切酶的切割位點（便于目的基因的插入）、具有標記基因即氨芐抗性基因Ampr（便于鑒定和篩選含有目的基因的受體細胞）。

（3）單獨A切割得一條長鏈，單獨B切也得一條長鏈，A和C同時切割得2個500bp和1個2666bp片段，B和C同時切割得2個250bp和1個3166bp片段，這說明該質粒上有一個A酶切割位點、一個B酶切割位點、2個C酶切割位點；A和C同時切割得2個500bp和1個2666bp片段，說明A和C酶的一個切點之間的長度為500bp；B和C同時切割得2個250bp和1個3166bp片段，說明B和C酶的一個切點之間的長度為250bp；若以A的切割位點為計算起點，則B的切割位點與A點最短長度為500+250=750bp，C的兩個切割位點與A點的最距離分別為500bp、1000bp。

（4）PR和PL都是啟動子，pBV220載體構建過程中把兩個啟動子串聯在一起，形成了雙啟動子，雙啟動子的作用可能是保證目的基因的高水平表達（高效轉錄）；溫控基因CIts857編碼對溫度敏感的CIts蛋白，CIts在30℃時具有抑制啟動子的活性，在42℃時失活，因此要促進工程菌目的基因表達就要使CIts蛋白失活，即促進工程菌目的基因表達的誘導溫度為42℃。