Question

【題目】細胞內具有多種miRNA對基因表達有重要的調節作用，研究人員利用基因編輯技術建立miRNA-301a（某種miRNA）基因敲除的小鼠模型，用于研究miRNA-301a的調節功能。請回答相關問題：

（1）下圖為miRNA形成和發揮作用的過程簡圖，據圖可知miRNA基因通過___________形成前體miRNA，然后經過________過程形成miRNA，miRNA通過________調控翻譯過程。

（2）構建miRNA基因敲除的小鼠。其作用機制如下圖所示。

注：gRNA與Cas9蛋白結合后可以切割DNA

①取miRNA基因：根據miRNA基因序列設計并合成______________________，然后通過_________技術擴增得到miRNA基因。同理構建gRNA的模板DNA。

②構建基因表達載體：利用________________________酶構建如下圖所示的基因表達載體。

③通過體外轉錄獲得miRNA-gRNA，再將miRNA-gRNA與Cas9混合后采用顯微注射技術注入小鼠__________________中。

（3）經上述操作獲得的8只小鼠稱為F0代。

①經過限制酶Ⅰ剪切后電泳檢測小鼠miRNA基因敲除情況如下圖所示。

F0代小鼠檢測其中5號為野生型，M為標準物）F0代中_____________號為基因敲除小鼠，經過基因測序后選擇_____________與敲除堿基對數目最多的4號小鼠雜交，產生F1代小鼠。

②用限制酶Ⅱ剪切后電泳檢測F1代小鼠如圖1所示。

從F1中選出4號和5號個體雜交產生F2代小鼠，然后用同種方法檢測F2代小鼠結果如上圖2所示，最終確定F2代中________號小鼠為miRNA基因敲除純合子小鼠。

Answer 1

【答案】轉錄 剪切、酶切、解旋（剪切、酶切過程必須有） 與mRNA結合阻止核糖體移動 引物 PCR 限制酶和DNA連接酶 受精卵 1234678號 野生型（或5號） Ⅱ-1號和Ⅱ-5號

【解析】

1、轉錄過程以四種核糖核苷酸為原料，以DNA分子的一條鏈為模板，在DNA解旋酶、RNA聚合酶的作用下消耗能量，合成RNA。

2、翻譯過程以氨基酸為原料，以轉錄過程產生的mRNA為模板，在酶的作用下，消耗能量產生多肽鏈，多肽鏈經過折疊加工后形成具有特定功能的蛋白質。

3、基因工程的操作步驟：目的基因的獲取（基因文庫獲取、PCR、人工合成）；構建基因表達載體（含目的基因、標記基因、啟動子、終止子、復制原點）；把目的基因導入受體細胞（顯微注射法、農桿菌轉化法、鈣離子處理法）；目的基因的檢測和鑒定（分子水平—DNA分子雜交法、分子雜交法、抗原抗體雜交法和個體水平—抗蟲、抗病接種實驗等）。

(1)根據miRNA形成和發揮作用的過程圖可知,miRNA基因首先通過轉錄形成前體miRNA,前體rniRNA接著經過剪切、酶切、解旋過程形成成熟的miRNA;miRNA和蛋白質結合后,形成miRNA -蛋白復合物,該復合物通過與mRNA結合后阻止核糖體在mRNA.上的移動，阻止了翻譯過程的繼續進行。

(2)構建miRNA基因敲除的小鼠要經歷3個步驟。

①獲取miRNA基因:根據miRNA基因序列設計并合成引物,然后通過PCR技術擴增得到miRNA基因。同埋構建gRNA的模板DNA。

②構建基因表達載體:利用限制性核酸內切酶和DNA連接酶這兩種工具酶構建基因表達載體,獲得同時含有miRNA和gRNA的基因片段。

③通過獲得的含有miRNA和gRNA的基因片段,在體外轉錄獲得miRNA-gRNA(一種mRNA;再將miRNA-gRNA與Cas9蛋白混合后,采用顯微注射技術注人小鼠受精卵中。miRNA-gRNA中的miRNA就可以通過堿基互補配對和DNA中的miRNA基因結合起來,將gRNA和Cas9蛋白定向地引導到miRNA基因所在的位置，gRNA和Cas9蛋白將miRNA基因從一個DNA上切除,這樣受精卵就出現了缺乏miRNA基因的DNA,受精卵發育形成的小鼠體細胞中也會出現不含有miRNA基因的DNA。

(3)①由于小鼠體細胞的同源染色體成對存在,因此同源染色體上的DNA也是成對存在的。5號野生型小鼠染色體上的兩個含有miRNA基因的DNA都是正常的，基因型假設為AA,經過限制酶I剪切后，只產生750 bp的DNA片 段。缺乏miRNA基因的一個DNA被酶切割后，產生的是500 bp的片段。因此,F0中1、2、3、4、6、7、8號均為基因敲除小鼠;經過基因測序后選擇野生型(5號)與敵除堿基對數目最多的4號小鼠雜交產生F小鼠。

②用限制酶II剪切后電泳檢測Ft小鼠,4號和5號個體都含有750 bp和500 bp的片段。它們雜交后產生F2小鼠, II1號和II5號只含有500 bp的片段,它們只含有缺乏miRNA的DNA,是miRNA基因敲除的純合子。