Question

【題目】科研人員運用兩種方法分離杜氏鹽藻、球等鞭金藻細胞的葉綠體，并提取葉綠體DNA，主要實驗步驟和結(jié)果如下，其中SDS能瓦解生物膜，氯仿異戊醇不溶于水且密度均大于水，DNA不溶于氯仿異戊醇。請回答：

步驟①收集藻細胞：將兩種藻細胞培養(yǎng)液進行預(yù)處理后，離心取沉淀物。

步驟②獲取葉綠體粗：提物4℃下分別破碎兩種藻細胞后，再分別用差速離心法和密度梯度離心法分離獲取葉綠體粗提物(原理示意圖如下)。

步驟③去除雜質(zhì)DNA：向步驟②的葉綠體粗提物中加入DNA酶、緩沖液，37℃靜置15min后，離心取沉淀物。

步驟④粗提葉綠體DNA：向步驟③獲得的葉綠體中加入緩沖液、SDS、蛋白酶K，60℃水浴2h，離心取上清液。再向上清液中加入氯仿異戊醇，在4℃下離心取　？　。

步驟⑤純化葉綠體DNA：向粗提溶液中加入3mol·L－1醋酸鈉及預(yù)冷的95%酒精，低溫靜置1h后，離心棄上清液。加預(yù)冷的95%酒精、離心洗滌1～2次，取沉淀物用超純水溶解。

步驟⑥D(zhuǎn)NA純度和濃度：測定利用分光光度法測量并計算葉綠體DNA的純度及濃度，結(jié)果如上右表(表中OD260/OD280值越接近1.8說明DNA越純)。

(1)步驟①中預(yù)處理時應(yīng)將藻液置于____處24h，以降低葉綠體中淀粉粒的含量，有利于分離得到完整葉綠體。步驟②在利用差速離心法分離獲得葉綠體前，需要先在____(填“低于”“等于”或“高于”)4 000r·min－1下離心去除細胞壁、核物質(zhì)等。

(2)步驟③依據(jù)的主要原理是____，去除的“雜質(zhì)DNA”來源于____。

(3)步驟④中離心后應(yīng)取____。步驟⑤中用95%的冷酒精離心洗滌過程要注意動作輕緩，其目的是____________________________________________________________。

(4)根據(jù)實驗結(jié)果分析，____法較適于分離提取葉綠體DNA，原因是_________________________________________。

Answer 1

【答案】黑暗 低于 DNA酶能催化DNA水解 細胞核 上清液 防止葉綠體DNA斷裂 差速離心 獲得的葉綠體DNA數(shù)量多且純度高

【解析】

根據(jù)題干信息分析。該實驗的目的是利用差速離心法和密度梯度離心法對杜氏鹽藻、球等鞭金藻細胞的葉綠體進行分離，并提取葉綠體DNA。據(jù)圖分析，差速離心法的原理是利用不同的轉(zhuǎn)速分離細胞勻漿中的各種物質(zhì)或結(jié)構(gòu)，最終獲得葉綠體，因此圖中的“？”應(yīng)該是不同于后面的轉(zhuǎn)速的；蔗糖密度梯度離心法的結(jié)果是小顆粒、中等顆粒和大顆粒分別位于試管的不同位置。

（1）為了降低葉綠體中淀粉粒的含量，有利于分離得到完整葉綠體，步驟①中預(yù)處理時應(yīng)該應(yīng)將藻液置于黑暗處24h。

（2）步驟③中加入的DNA酶能夠?qū)�DNA水解，進而達到去除雜質(zhì)DNA的目的；步驟②離心獲得的是細胞壁、核物質(zhì)等，因此該雜質(zhì)DNA來源于細胞核。

（3）步驟④為粗提葉綠體DNA，離心取上清液并加入氯仿異戊醇，而DNA不溶于氯仿異戊醇，因此在4℃下離心取的是上清液。步驟⑤中用95%的冷酒精離心洗滌過程要注意動作輕緩，以防止葉綠體DNA斷裂。

（4）根據(jù)題意分析，已知OD260/OD280值越接近1.8說明DNA越純，則表格數(shù)據(jù)顯示，差速離心法獲得的葉綠體DNA數(shù)量多且純度高，比較適于分離提取葉綠體DNA。