Question

ch1L基因是藍藻擬核DNA上與葉綠素合成有關的基因。為研究該基因對葉綠素合成的控制，需要構建該種生物缺失ch1L基因的變異株細胞。構建過程如下：

第①步：用PCR技術從藍藻環狀DNA中擴增出ch1L基因片段。

第②步：將ch1L基因與質粒構建形成重組質粒1。

第③步：將重組質粒1中ch1L基因中部0.8kb片段刪除，用一段紅霉素抗性基因取代之，得到重組質粒2。

第④步：將重組質粒2導入藍藻細胞，由于改造后的基因與ch1L基因仍有很長的序列相同，所以能準確地與其發生同源重組，產生出缺失ch1L基因的突變株。請根據上述資料，回答下列問題：

（1）第①步用PCR技術擴增DNA片段時用到的耐高溫的酶通常是指什么酶？         。

PCR擴增DNA時必須加入引物，引物的實質是          ，其作用是                                。

（2）利用PCR技術擴增DNA一般要經過三十多次循環，每次循環都要經過三個步驟，其中“復性”這一步驟發生的變化是                   。為消除PCR擴增過程當中外源DNA污染造成的影響，應如何設置對照？                       。

（3）構建重組質粒1、2時，為保證成功率，往往使用                        酶

對基因和質粒進行切割，以切出相同的黏性末端，便于連接。此酶的作用是將DNA分子的              鍵打開。

（4）質粒是基因工程中最常用的運載體，其化學本質是         ，此外還可用噬菌體、動植物病毒作用為運載體。

（5）導入重組質粒2以后，往往還需要進行檢測和篩選，可用            制成探針，檢測是否導入了重組基因，在培養基中加入              可將變異株細胞篩選出來。

Answer 1

（1）TaqDNA聚合酶    一小段DNA或RNA   與模板結合，使DNA聚合酶從引物3’端延伸DNA鏈

（2）引物通過堿基互補與DNA模板鏈結合    對照組不加DNA模板，其它條件相同

（3）同一種DNA限制性內切酶   磷酸二酯鍵

（4）小型環狀DNA

（5）紅霉素抗性基因     紅霉素

解析:

（1）DNA聚合酶催化DNA復制過程；引物一般為一小段單鏈DNA，新的DNA單鏈將接在引物后延伸。

（2）PCR分三步：第一是變性，主要是DNA雙鏈解開，第二是退火，也稱復性，主要是引物與DNA單鏈結合，第三是延伸，主要是新的DNA單鏈延伸。通過對照，說明問題，如果不加DNA模板仍有新DNA產生，說明有外源DNA污染。

（3）注意用同一種限制性內切酶，才能切出相同的黏性末端，從而才能相連；注意限制性內切酶破壞的是磷酸二酯鍵，不是氫鍵。

（4）了解質粒本質。

（5）因為重組質粒中含有紅霉素抗性基因，所以可用紅霉素抗性基因制成探針，讓探針與重組質粒中含有紅霉素抗性基因發生雜交。在含有紅霉素的培養基中，如果細菌仍能生存，說明導入了重組基因。