Question

【題目】胰島素A、B鏈分別表達法是生產(chǎn)胰島素的方法之一． 圖1是該方法所用的基因表達載體，圖2表示利用大腸桿菌作為工 程菌生產(chǎn)人胰島素的基本流程（融合蛋白 A、B分別表示β﹣半乳糖苷酶與胰島素A、B鏈融合的蛋白）．

（1）圖1基因表達載體中沒有標注出來的基本結(jié)構(gòu)是__。

（2）圖1中啟動子是__ 酶識別和結(jié)合的部位，有了它才能啟動目的基因的表達；氨芐青霉素抗性基因的作用是__。

（3）構(gòu)建基因表達載體時必需的工具酶有__。

（4）β﹣半乳糖苷酶與胰島素A鏈或B鏈融合表達，可將胰島素肽鏈上蛋白酶的切割位點隱藏在內(nèi)部，其意義在于__。

（5）溴化氰能切斷肽鏈中甲硫氨酸羧基端的肽鍵，用溴化氰處理相應的融合蛋白能獲得完整的A鏈或B鏈，且β﹣半乳糖苷酶被切成多個肽段，這是因為__。

（6）根據(jù)圖2中胰島素的結(jié)構(gòu)，請推測每個胰島素分子中所含游離氨基的數(shù)量．你的推測結(jié)果是__，理由是__。

（7）如果圖1所示的載體可被A、B、C三種限制性內(nèi)切酶同時切割．單獨A切割得一條長鏈，單獨B切也得一條長鏈，A和C同時切割得2個500bp和1個2666bp片段，B和C同時切割得2個250bp和1個3166bp片段．若以A的切割位點為計算起點，則B的切割位點與A點最短長度為__，C的兩個切割位點與A點的最短距離分別為__、__。

（8）如限制酶SmaI能識別如圖3的「5‘﹣CCCGGG﹣3’」6個堿基序列，并在中央（圖中箭頭位置）切斷DNA．則用限制酶SmaI處理如圖的線狀雙鏈DNA時，請以箭頭標出切割位置。

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Answer 1

【答案】終止子 RNA聚合 作為標記基因，將含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌篩選出來 限制酶和DNA連接酶 防止胰島素的A、B鏈被菌體內(nèi)蛋白酶降解 β﹣半乳糖苷酶中含多個甲硫氨酸，而胰島素A、B鏈中不含甲硫氨酸 至少2個 兩條肽鏈的一端各有一個游離的氨基，氨基酸的R基中可能還含有游離的氨基 750bp 500bp 1000bp

【解析】

（1）根據(jù)題意和圖示分析可知：圖1基因表達載體中已有目的基因、啟動子和標記基因，所以沒有標注出來的基本結(jié)構(gòu)是終止子。

（2）圖1中啟動子是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，有了它才能啟動目的基因的表達即轉(zhuǎn)錄過程；氨芐青霉素抗性基因的作用是作為標記基因，將含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌篩選出來。

（3）構(gòu)建基因表達載體的過程中，必須用相同的限制酶切割（含目的基因的外源DNA分子）和運載體，以產(chǎn)生相同的黏性末端，再加入DNA連接酶將目的基因和運載體連接形成重組DNA分子。

（4）β﹣半乳糖苷酶與胰島素A鏈或B鏈融合表達，可將胰島素肽鏈上蛋白酶的切割位點隱藏在內(nèi)部，這樣可以防止胰島素的A、B鏈被菌體內(nèi)蛋白酶降解。

（5）溴化氰能切斷肽鏈中甲硫氨酸羧基端的肽鍵，由于β﹣半乳糖苷酶中含有多個甲硫氨酸，而胰島素的A、B鏈中不含甲硫氨酸，所以用溴化氰處理相應的融合蛋白能獲得完整的A鏈或B鏈，且β﹣半乳糖苷酸被切成多個肽段。

（6）由于一個肽鏈中至少有一個游離的氨基和一個游離的羧基，在肽鏈內(nèi)部的R基中可能也有氨基和羧基，而胰島素含有A鏈和B鏈，所以每個胰島素分子中所含游離氨基的數(shù)量至少是2個。

（7）分析題意可知，限制酶A和B在質(zhì)粒上均只含有一個切割位點，限制酶C在質(zhì)粒上有2個切割位點。由于B和C同時切割得2個250bp和1個3166bp片段，說明限制酶B的切點在限制酶C的兩個短距離的切點之間，因此若以A的切割位點為計算起點，則B的切割位點與A點最短長度=500+250=750bp，則畫圖可知C的兩個切割位點與A點的最短距離分別為500bp、1000bp。

（8）分析圖解可知，限制酶SmaI能識別如圖3的「5‘﹣CCCGGG﹣3’」6個堿基序列，，并在中央切斷DNA形成的平末端，因此它的切割位點為C和G之間。