Question

【題目】下面是將乙肝病毒控制合成病毒表面主蛋白的基因HBsAg導入巴斯德畢赤酵母菌生產乙肝疫苗的過程及有關資料，請分析回答下列問題。

資料1：巴斯德畢赤酵母菌是一種甲基營養型酵母菌，能將甲醇作為其唯一碳源，此時AOX1基因受到誘導而表達【5’AOX1和3’AOX1（TT）分別是基因AOX1的啟動子和終止子】。

資料2：巴斯德畢赤酵母菌體內無天然質粒，所以科學家改造出了如圖所示的pPIC9K質粒用作載體，其與目的基因形成的重組質粒經酶切后可以與酵母菌染色體發生同源重組，將目的基因整合于染色體中以實現表達。

（1）如果要將HBsAg基因和pPIC9K質粒重組，應該在HBsAg基因兩側的A和B位置接上________________、 ____________限制酶識別序列， 這樣設計的優點是避免質粒和目的基因自身環化。

（2）酶切獲取HBsAg基因后，需用____________將其連接到pPIC9K質粒上，形成重組質粒，并將其導入大腸桿菌以獲取____________。

（3）步驟3中應選用限制酶____________來切割重組質粒獲得重組DNA，然后將其導入巴斯德畢赤酵母菌細胞。

（4）為了確認巴斯德畢赤酵母菌轉化是否成功，在培養基中應該加入卡拉霉素以便篩選，轉化后的細胞中HBsAg基因是否轉錄出mRNA，可以用____________方法進行檢測。

（5）轉化的酵母菌在培養基上培養一段時間后，需要向其中加入____________以維持其生活，同時誘導HBsAg基因表達。

（6）與大腸桿菌等細菌相比，用巴斯德畢赤酵母菌細胞作為基因工程的受體細胞，其優點是在蛋白質合成后，細胞可以對其進行____________并分泌到細胞外，便于提取。

Answer 1

【答案】(8分)

(1)SnaBⅠ AvrⅡ (2)DNA連接酶 大量重組質粒（重組質粒不得分） (3)BglⅡ

(4)DNA分子雜交 (5)甲醇 (6)加工(修飾)

【解析】(1)重組質粒上的目的基因若要表達，目的基因的首端和尾端需含有啟動子和終止子。而SnaBⅠ、AvrⅡ識別的序列在啟動子與終止子之間，只要在目的基因兩側的A和B位置分別接上這兩種序列，并用SnaBⅠ、AvrⅡ這兩種限制酶對質粒和目的基因同時進行切割，便會各自出現相同的黏性末端，便于重組與表達，同時可防止自身環化，因此在HBsAg基因兩側的A和B位置應接上SnaBⅠ和AvrⅡ限制酶的識別序列。

(2)用DNA連接酶可將切割后的HBsAg基因和pPIC9K質粒連接成重組質粒；將重組質粒導入大腸桿菌體內的目的是：利用大腸桿菌的無性繁殖，短時間內獲取大量的重組質粒。

(3)重組DNA的兩側分別是啟動子和終止子，除BglⅡ外，其他限制酶均會破壞含有啟動子、終止子的目的基因。所以步驟3中應選用限制酶BglⅡ來切割重組質粒獲得重組DNA，然后將其導入巴斯德畢赤酵母菌細胞。

(4)可用DNA分子雜交技術檢測巴斯德畢赤酵母菌內是否導入了目的基因。

(5)資料1顯示，甲醇為該酵母菌的唯一碳源，同時可誘導HBsAg基因表達，據此可知：轉化的酵母菌在培養基上培養一段時間后，需要向其中加入甲醇以維持其生活，同時誘導HBsAg基因表達。

(6) 大腸桿菌等細菌為原核生物，細胞內沒有對分泌蛋白進行加工修飾的內質網和高爾基體，而巴斯德畢赤酵母菌為真核生物，其細胞內有內質網和高爾基體等復雜的細胞器。所以與大腸桿菌等細菌相比，用巴斯德畢赤酵母菌細胞作為基因工程的受體細胞，其優點是在蛋白質合成后，細胞可以對其進行加工修飾并分泌到細胞外，便于提取。