Question

【題目】對棉纖維基因GhRACK1的正常啟動子P進行改造，獲得了P1、P2、P3、P4缺失體�？蒲腥藛T對正常啟動子P及其4種缺失體（P1﹣P4）進行了實驗研究。

（1）首先利用PCR技術擴增正常啟動子P，方法如圖1。

①不能直接根據片段Ⅰ擴增出正常啟動子P，因為__。

②利用__酶處理使片段Ⅰ成為環狀DNA。

③將環狀DNA用__酶處理，得到片段Ⅱ．欲擴增出正常啟動子P，需選用的引物組合為__。

（2）利用有關酶對正常啟動子P進行切割，得到不同程度缺失體（P1﹣P4），圖2表示正常啟動子P缺失示意圖。

（3）利用正常啟動子P及其4種缺失體（P1﹣P4）分別構建了基因表達盒，如圖3所示。

（4）再將5種基因表達盒分別轉入相同質粒，構建相應的植物表達載體。然后將其導入農桿菌，最后導入煙草細胞中。用含有__的培養基對煙草細胞進行篩選，分別獲得了含有正常啟動子P及其4種缺失體（P1﹣P4）的轉基因煙草。將植物組織浸入適量__溶液中，觀察煙草細胞gus基因是否表達，實驗結果如下表。

	根	葉	花粉
正常啟動子P	幼根+根毛+	﹣	﹣
P1	+	+	+
P2	+	+	+
P3	+	+	+
P4	+	+	+

有藍色：+ 無藍色：﹣

如果煙草細胞gus基因成功表達，則細胞呈現藍色．實驗結果表明__。

與P1﹣P4的實驗結果相比，說明正常啟動子P發揮不同功能的關鍵序列位于圖2的__。（填字母）

Answer 1

【答案】正常啟動子P左側序列未知 Bgl II和DNA連接 Msc I C和B 卡那霉素 X﹣Gluc 正常啟動子P驅動gus基因在幼根及根毛中特異性表達，而缺失體中gus基因在根、葉和花粉均表達 M、Q

【解析】

基因工程技術的基本步驟：

（1）目的基因的獲�。悍椒ㄓ袕幕�因文庫中獲取、利用PCR技術擴增和人工合成。

（2）基因表達載體的構建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等。

（3）將目的基因導入受體細胞：根據受體細胞不同，導入的方法也不一樣。將目的基因導入植物細胞的方法有農桿菌轉化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因導入動物細胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因導入微生物細胞的方法是感受態細胞法。

（4）目的基因的檢測與鑒定。

a.分子水平上的檢測：①檢測轉基因生物染色體的DNA是否插入目的基因﹣﹣DNA分子雜交技術；②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA﹣﹣分子雜交技術；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質﹣﹣抗原﹣抗體雜交技術。

b.個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

（1）①利用PCR技術擴增DNA的前提條件是要有已知核苷酸序列的目的基因，但正常啟動子P左側序列未知，因此不能直接根據片段Ⅰ擴增出正常啟動子P。

②根據圖1中環狀DNA分子中的酶切位點可知，要得到環狀DNA分子時，首先利用Bgl II酶切割片段Ⅰ，再用DNA連接酶處理使片段Ⅰ成為環狀DNA。

③根據圖1可知，將環狀DNA用Msc I酶處理，得到片段Ⅱ。PCR反應中是從引物的3‘端開始合成新DNA鏈的，因此欲擴增出正常啟動子P，需選用的引物組合為C和B。

（4）根據圖3可知，標記基因是卡那霉素抗性基因，因此導入煙草細胞中后，用含有卡那霉素的培養基對煙草細胞進行篩選，分別獲得了含有正常啟動子P及其4種缺失體（P1﹣P4）的轉基因煙草。由于gus基因表達產物可將X﹣Gluc水解生成藍色產物，因此將植物組織浸入適量X﹣Gluc溶液中，觀察煙草細胞gus基因是否表達。實驗結果表明正常啟動子P驅動gus基因在幼根及根毛中特異性表達，而缺失體中gus基因在根、葉和花粉均表達；與P1﹣P4的實驗結果相比，說明正常啟動子P發揮不同功能的關鍵序列位于圖2的M、Q。