Question

【題目】為增加油葵種子中的含油量，科學家嘗試將花生中的酶A基因導入油葵細胞，獲得轉基因油葵新品種。

（1）為獲取目的基因，可從花生細胞中提取_________，經逆轉錄形成cDNA。以此cDNA為模板通過PCR技術擴增目的基因。

（2）構建重組DNA分子（如圖所示）最好選用_________限制酶，目的是可避免_________。

（3）普通大腸桿菌細胞中沒有抗四環素基因和抗氨芐青霉素基因，將構建的重組DNA分子導入農桿菌中,將獲得的農桿菌接種在含_________的固體平板上培養得到含重組質粒的單菌落，再利用培養基震蕩培養，可以得到用于轉化的浸染液。

（4）剪取油葵的葉片放入浸染液中一段時間后，經過篩選獲得轉基因油菜細胞。最后經過__________________

培育成轉基因油葵植株。此種技術的原理是_________。

（5）研究發現，如果將該酶A的20位和24位氨基酸變為半胱氨酸，其催化能力將提高2倍。通過蛋白質工程對酶A進行改造，所需步驟有_________。

a．蛋白質的結構設計 b．蛋白質的結構和功能分析

c．蛋白質結構的定向改造 d．酶A基因的定向改造

e．將改造后的酶A基因導入受體細胞 f．將定向改造的酶A導入受體細胞

（6）經過種植轉基因油葵發現，雖然轉基因油葵種子中含油量上升，但是抗灰霉菌的能力丟失，其原因是_________。

Answer 1

【答案】mRNA BamHⅠ和 PstⅠ 質粒自身的黏性末端連接或目的基因與質粒反向連接 氨芐青霉素 植物組織培養技術 植物細胞的全能性 b、a、d、e 抗灰霉菌基因沒有表達（或丟失等）

【解析】

基因工程技術的基本步驟：

（1）目的基因的獲取：方法有從基因文庫中獲取、利用PCR技術擴增和人工合成。

（2）基因表達載體的構建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等。

（3）將目的基因導入受體細胞：根據受體細胞不同，導入的方法也不一樣。將目的基因導入植物細胞的方法有農桿菌轉化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因導入動物細胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因導入微生物細胞的方法是感受態細胞法。

（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術；②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA--分子雜交技術；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質--抗原-抗體雜交技術；個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

（1）逆轉錄過程需要從供體細胞內提取出的 mRNA 為模板，以脫氧核苷酸為原料合成 cDNA。

（2）構建重組 DNA 分子時選用的限制酶要不破壞目的基因，所以不能用 EcoR I，同時盡量防止質粒自身的黏性末端連接或目的基因與質粒反向連接，所以最好選用兩種限制酶， 即 BamHⅠ和 PstⅠ。

（3）根據限制酶的切割位點，由于使用 BamHⅠ和 PstⅠ會破壞抗四環素標記基因，但抗氨芐青霉素的標記基因是完整的所以只能用含氨芐青霉素的培養基篩選含重組質粒的單菌落。

（4）得到轉基因細胞后，要培養轉基因植株，需要用植物的組織培養技術才能實現，其依據的原理是植物細胞的全能性。

（5）蛋白質工程的步驟是：蛋白質的結構和功能分析→蛋白質的結構設計→酶 A 基因的定向改造→將改造后的酶 A 基因導入受體細胞→獲得所需蛋白質。

（6）轉基因油葵種子中含油量上升，但抗灰霉菌的能力丟失，原因可能是抗灰霉菌基因未表達或丟失。