Question

【題目】圖示pIJ702是一種常用質粒，其中tsr為硫鏈絲菌素（一種抗生素）抗性基因；mel為黑色素合成基因，其表達能使白色的鏈霉菌菌落變成黑色菌落；而限制酶SacⅠ、 SphⅠ， BglⅠ在pIJ702上分別只有一處識別序列。回答下列問題。

表1

	pIJ702	pZHZ8
BglⅡ	5．7kb	6．7kb

表2

固體培養基中硫鏈絲菌素濃度（μg/mL）	0	1	2	5	10
不含質粒的鏈霉菌生長狀況	+++++	+++	+	-	-

“+”表示生長；“-”表示不生長。

（1）限制性內切核酸酶可以識別雙鏈DNA中特定核苷酸序列，并使每條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間_______的斷裂，切割形成的末端有_______兩種。

（2）以SacⅠ和SphⅠ切取的目的基因置換質粒PIJ702上長度為0．4kb的SacⅠ/sphⅠ片段，構建重組質粒pZHZ8。上述兩種質粒的限制酶酶切片段長度見表1。由此判斷目的基因的片段長度為_____kb，判定目的基因中含有一個BglⅡ切割位點的理由是____________________________。

（3）導入目的基因時，首先用______處理鏈霉菌使其成為感受態細胞，再將重組質粒pZHZ8溶于________中與感受態細胞混合，在一定的溫度下可以促進鏈霉菌完成______過程。

（4）不含質粒的鏈霉菌在含硫鏈絲菌素的固體培養基上生長狀況如表2所示。若要篩選導入pzHZ8的鏈霉菌細胞，所需硫鏈絲菌素濃度至少應在______μg/mL以上，挑選成功導入pZHZ8的鏈霉菌的具體方法是________________________。

Answer 1

【答案】磷酸二酯鍵 黏性末端和平末端 1．4 pIJ702上的原有BglⅡ位點被目的基因置換得到的環狀pZH28，仍能被BglⅡ切割成一條線段 Ca2+ 緩沖液 轉化 5 根據導入pIJ702的鏈霉菌菌落呈黑色、導入pZHZ8的鏈霉菌菌落呈白色的特點，通過觀察菌落的顏色進行挑選

【解析】

該題主要考察了基因工程的相關操作，基因工程的基本操作步驟為目的基因的獲取、基因表達載體的構建、將目的基因導入到受體細胞、目的基因的檢測與鑒定。限制性核酸內切酶主要作用于識別序列的磷酸二酯鍵，切割完以后可能會產生黏性末端或者是平末端。將目的基因導入受體細胞時，常常使用Ca2+使得受體細胞成為感受態細胞。

（1）限制性內切核酸酶是作用于其所識別序列中剪切位點的磷酸二酯鍵，不同的限制酶可以獲得不同的末端，主要分為黏性末端和平末端；

（2）由題干可知，質粒PIJ702上具有長度為0．4kb的SacⅠ/sphⅠ片段，使用SacⅠ和SphⅠ切取質粒會多置換下0.4kb的片段，而BglⅡ在原質粒和重組質粒上的切割片段相差1.0kb，介于BglⅡ的識別位點位于SacⅠ和SphⅠ之間，所以推測目的基因的片段長度應該為1.0+0.4=1.4kb；在表格中可以反應出重組質粒可以被BglⅡ限制酶切割，切割后稱為一條線段，但原有質粒上的相關片段已經被SacⅠ和SphⅠ置換為目的基因，因此推測目的基因中也含有1個BglⅡ切割位點；

（3）將目的基因導入到受體細胞之前，需要將受體細胞用Ca2+處理使得受體細胞成為感受態細胞；然后重組質粒要溶解到緩沖液中與感受態細胞融合；從而促進鏈霉菌完成轉化的過程；

（4）根據圖中的表格可知，要想對重組的鏈霉菌細胞進行篩選，應該滿足不含質粒的鏈霉菌無法生長的要求，因此所需硫鏈絲菌素濃度至少應在5μg/mL以上；在該質粒上存在一個mel基因，其表達的產物會使得白色的鏈霉菌菌落變成黑色菌落，所以導入pIJ702的鏈霉菌菌落呈黑色，而重組質粒pZHZ8在構建的時候破壞了mel基因，所以該重組質粒導入到鏈霉菌后菌落呈白色，后通過觀察菌落的顏色進行挑選。