Question

【題目】某種熒光蛋白(GFP)在紫外光或藍光激發下會發出綠色熒光,這一特性可用于檢測細胞中目的基因的表達。某科研團隊將某種病毒的外殼蛋白(L1)基因連接在GFP基因的5'末端,獲得了L1-GFP融合基因(簡稱甲),并將其插入質粒P0。構建了真核表達載體P1,其部分結構和酶切點的示意圖如下,圖中E1~E4四種限制酶產生的黏性末端各不相同。

回答下列問題:

(1)據圖推斷,該團隊在將甲插入質粒P0時,使用了兩種限制酶,這兩種酶是__________。圖中的啟動子可作為_______________的結合位點，催動轉錄的進行。

(2)將P1轉入體外培養的牛皮膚細胞后,若在該細胞中觀察到了_________,則說明L1基因在牛的皮膚細胞中完成表達。基因工程的核心步驟是______________________。

(3)通過___________的方法將目的基因導入牛的________中，再經過早期胚胎培養，胚胎移植等過程，獲得含有甲的轉基因牛。

(4)為了檢測甲是否存在于克隆牛的不同組織細胞中,某同學用PCR方法進行鑒定。在鑒定時應分別以該牛不同組織細胞中的______________ (填"mRNA""總RNA"或"核DNA")作為PCR模板。

Answer 1

【答案】E1和E4 RNA聚合酶 綠色的熒光 基因表達載體的構建 顯微注射 受精卵 核DNA

【解析】

基因工程技術的基本步驟：

（1）目的基因的獲取：方法有從基因文庫中獲取、利用PCR技術擴增和人工合成。

（2）基因表達載體的構建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等。

（3）將目的基因導入受體細胞：根據受體細胞不同，導入的方法也不一樣。將目的基因導入植物細胞的方法有農桿菌轉化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因導入動物細胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因導入微生物細胞的方法是感受態細胞法。

（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術；②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA--分子雜交技術；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質--抗原-抗體雜交技術。個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

(1) 使用E1、E4這兩種酶進行酶切可以保證目的基因甲的完整性， 圖中的啟動子可作為RNA聚合酶的結合位點，催化轉錄的進行。

(2) 在該細胞中觀察到了綠色的熒光，說明基因已表達，即L1基因在牛的皮膚細胞中完成了轉錄和翻譯過程。基因工程的核心步驟是基因表達載體的構建。

(3)通過顯微注射的方法將目的基因導入牛的受精卵中，再進行體外培養、胚胎移植等相關操作獲得轉基因牛。

(4) 為檢測L1-GFP融合基因是否存在于克隆牛的不同組織細胞中，某同學用PCR方法進行鑒定。PCR技術是體外DNA復制技術，故在鑒定時應分別以該牛不同組織細胞中的核DNA作為PCR模板 。